α2腎上腺素受體基因多態(tài)性與2型糖尿病患者伴無癥狀心肌缺血的關(guān)系

高 晶， 陳秋靜， 張 彬， 陸 林， 張瑞巖， 張 奇， 胡 健， 楊震坤， 沈衛(wèi)峰

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200011;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院心內(nèi)科，上海200025)

無癥狀心肌缺血(silent myocardial ischemia，SMI)是指缺乏胸痛或與心肌缺血相關(guān)的主觀癥狀情況下心肌缺血［1-2］，多見于糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者，其發(fā)生率為10%～30%［3］。因此，對患有冠心病(coronary artery disease，CAD)的糖尿病患者進(jìn)行SMI篩查是十分必要的［4］。α2-腎上腺素受體(adrenergic receptor，AR)廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，共同參與調(diào)節(jié)交感系統(tǒng)的多種生理功能，并與心血管疾病發(fā)病和疼痛調(diào)節(jié)有關(guān)［5］。α2-AR有3種亞型，即α2AAR、α2B-AR 和α2C-AR［5］。α2A-AR、α2B-AR 和α2C-AR的基因依次定位于10、2和4號染色體上，已發(fā)現(xiàn)人類α2B-AR基因的插入(insertion，I)/缺失(deletion，D)多態(tài)性(3個(gè)谷氨酸殘留物)(rs4066772)在受體第3細(xì)胞內(nèi)環(huán)影響脫敏功能［6-7］。α2A-AR 啟動子區(qū)域 C-1291G 多態(tài)性(rs1800544)及α2C-AR基因4個(gè)氨基酸缺失多態(tài)性(rs2234888)分別被報(bào)道與神經(jīng)和心血管疾病相關(guān)［8-9］。然而，仍未被發(fā)現(xiàn)這些遺傳變異與SMI的潛在關(guān)聯(lián)，特別是在DM方面。

為此，我們對患有CAD的2型DM(type 2 diabetes mellitus，T2DM)伴 SMI患者和T2DM 伴心絞痛患者的α2A-AR、α2B-AR和α2C-AR基因多態(tài)性分布情況進(jìn)行了分析。

材料和方法

一、研究人群

隨機(jī)選取上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院體檢中心107名無糖尿病及CAD、無正在使用營養(yǎng)補(bǔ)充劑或藥物、肝腎功能和心電圖正常者作為對照組，男72名，女35名，年齡51～85歲。選取上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院2005年1月至2006年2月心臟內(nèi)科門診及住院患者經(jīng)血管造影證實(shí)患有CAD的T2DM患者321例，其中T2DM伴SMI患者129，男92例，女37例，年齡45～84歲;T2DM伴心絞痛患者192例，男124例，女68例，年齡44～89歲。

二、診斷標(biāo)準(zhǔn)

CAD診斷依據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果。冠狀動脈管腔狹窄≥70%定義為CAD，冠狀動脈左主干狹窄≥50%作為2支血管病變。129例T2DM伴SMI患者在24 h動態(tài)心電圖檢查中有瞬時(shí)的無癥狀ST段壓低，為SMI組。192例T2DM伴心絞痛患者心電圖檢查符合心絞痛，并有心絞痛或心絞痛相關(guān)事件，歸為心絞痛組。入選患者排除了急性心肌梗死、嚴(yán)重心力衰竭、需要透析治療的腎功能衰竭、有嚴(yán)重危及生命的疾病或炎癥患者。通過C-肽測定排除1型DM患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得了知情同意書。

三、方法

1.生化項(xiàng)目評估 采集禁食8 h以上的空腹血，分離血清并在-80℃凍存。測定血糖、血脂［包括總膽固醇(TG)、甘油三酯(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、脂蛋白(a)、載脂蛋白A1(apo A1)、載脂蛋白B100(apo B100)］和腎功能［包括尿素(Urea)、肌酐(Cr)和尿酸(UA)］水平。儀器為美國貝克曼-庫爾特公司全自動LX-20型生化分析儀，試劑為美國貝克曼-庫爾特公司提供的原裝試劑盒。

2.引物設(shè)計(jì) 應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件(美國ABI公司)設(shè)計(jì)引物，見表1。

表1 引物設(shè)計(jì)

3.DNA提取 使用新鮮血液及DNA提取試劑盒(美國 Qiagen公司)來制備基因組DNA。DNA在使用前凍存于-80℃。

4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和基因分型 用PCR和限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)或測序的方法進(jìn)行基因分型。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括PCR 緩沖液、10 pmol引物、2.5單位 Taq DNA聚合酶(美國 Promega公司)和0.5μg模板 DNA。PCR 反應(yīng)條件:94℃變性5 min、94 ℃變性 60s、退火 60s、72℃延伸 60 s，經(jīng)35個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，先用純化試劑盒(美國Promega公司)進(jìn)行純化，再使用ABI PRISM 3700 DNA分析儀(美國ABI公司)測序并進(jìn)行多態(tài)性分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、基線特征

正常對照組、SMI組和心絞痛組在年齡、性別方面無差異，SMI組和心絞痛組在年齡、性別、吸煙、血壓、體重指數(shù)(body mass index，BMI)、血脂、腎功能、CAD嚴(yán)重程度及用藥方面無差異，SMI組患者罹患T2DM的持續(xù)時(shí)間高于心絞痛組(P=0.003)，見表2。

二、多態(tài)性基因型分布與等位基因頻率

SMI組和心絞痛組基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡。2組α2B-AR I/D基因多態(tài)性基因型分布與等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.008、0.037)。SMI組I/I基因型頻率(34.9%)顯著高于心絞痛組(19.8%，P=0.002)，見表3。2組α2A-AR C-1291G 與α2C-AR I/D多態(tài)性基因型分布及等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。正常對照組α2B-AR基因I/D多態(tài)性 D/D、I/D和I/I的基因型頻率分別為15.0%、57.9% 及 27.1%，與SMI組和心絞痛組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。α2A-AR(-1291C/G)多態(tài)性位點(diǎn)的RFLP圖譜見圖1。α2B-AR(I/D，301/301)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。α2C-AR(I/D，325/322)DD型測序圖見圖3，α2C-AR(I/D，325/322)II型測序圖見圖4，α2C-AR(I/D，325/322)ID型測序圖見圖5。

表2 正常對照組、糖尿病伴SMI患者和心絞痛患者的比較

表3 多態(tài)性基因型分布和等位基因頻率 ［例(%)］

圖1 α2A-AR(-1291C/G)多態(tài)性位點(diǎn)的RFLP圖譜

圖2 α2B-AR(I/D，303/301)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

三、多變量回歸分析

用多變量Logistic回歸分析評估DM患者發(fā)生SMI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，包括基因和心血管疾病危險(xiǎn)因素。結(jié)果顯示，罹患DM的持續(xù)時(shí)間和α2B-AR基因多態(tài)性的I/I基因型是T2DM患者發(fā)生SMI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表4。

表4 T2DM患者發(fā)生SMI的多變量Logistic回歸分析

圖3 α2C-AR(I/D，325/322)DD型測序圖

圖4 α2C-AR(I/D，325/322)II型測序圖

圖5 α2C-AR(I/D，325/322)ID型測序圖

討 論

DM患者有65%～80%死于冠狀動脈疾病［10-11］。然而，DM患者SMI產(chǎn)生的機(jī)制仍然不明。由于神經(jīng)病變是DM的主要并發(fā)癥，本研究結(jié)果顯示罹患DM的持續(xù)時(shí)間是發(fā)生SMI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)α2B-AR I/D多態(tài)性I/I基因型與DM患者發(fā)生SMI有關(guān)。對無癥狀CAD來說，這可能是一個(gè)新的遺傳學(xué)危險(xiǎn)因素的發(fā)現(xiàn)。

α2A-AR、α2B-AR和α2C-AR都有基因多態(tài)性。已有研究表明α2B-AR I/D基因多態(tài)性與心血管疾病有關(guān)，其中D/D基因型與CAD急性發(fā)作、院前致死性心肌梗死/心源性猝死以及高血壓有關(guān)［12］。過表達(dá)α2B-AR的D多態(tài)性基因雖然不影響配體結(jié)合，但能降低G蛋白偶聯(lián)受體激酶介導(dǎo)的磷酸化，造成短期促進(jìn)激動劑脫敏功能完全喪失［7］。脫敏過程可調(diào)節(jié)細(xì)胞生理狀態(tài)并應(yīng)對環(huán)境的改變。這些發(fā)現(xiàn)表明α2B-AR基因D多態(tài)性在功能調(diào)節(jié)能力方面較I等位基因差。由此推測在α2-AR激動劑刺激下，I/I基因型可能更與鎮(zhèn)痛作用相關(guān)。在DM狀態(tài)下，由于交感神經(jīng)的緊張度增加等因素，使疼痛的耐受力增加，這些過程可能加速了DM進(jìn)展，并與遺傳易感性共同導(dǎo)致DM患者SMI的發(fā)生。

α2A-AR和α2C-AR基因多態(tài)性與神經(jīng)精神疾病和心血管疾病有關(guān)［8-9］。Leiphart等［13］在發(fā)生神經(jīng)性疼痛的神經(jīng)組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)這2種受體亞型的mRNA表達(dá)改變。動物實(shí)驗(yàn)表明α2A-AR、α2C-AR及α2B-AR同樣和疼痛的感知和調(diào)節(jié)有關(guān)［14］。本研究結(jié)果顯示α2A-AR和α2C-AR基因多態(tài)性頻率在SMI和心絞痛患者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這需要更大樣本量的研究來確認(rèn)這些結(jié)果。

本研究也存在一些局限性。首先，目前研究中SMI的檢測方法是不夠的。從DM患者中篩選出SMI者的方法仍不明確。運(yùn)動耐力測試、動態(tài)心電圖記錄、負(fù)荷超聲心動圖和計(jì)算機(jī)斷層掃描冠狀動脈鈣化常常用來檢測SMI，但心肌灌注顯像似乎更加準(zhǔn)確。其次，2組樣本量相對較小，因此除α2B-AR基因多態(tài)性之外，其他基因型和等位基因頻率的顯著差異較難檢出。再次，本研究中的SMI患者被定義為動態(tài)心電圖過程中有瞬時(shí)無癥狀ST段壓低的CAD患者［15］，而另一些研究則使用壓力測試檢查。因此，本研究可能會丟失部分在壓力或嚴(yán)重勞累而非休息狀態(tài)下發(fā)生SMI的患者。

綜上所述，α2B-AR基因多態(tài)性I/I基因型與患有CAD的T2DM患者發(fā)生SMI有關(guān)。

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