2型糖尿病患者CR1基因多態(tài)性與紅細胞CR1數(shù)量、黏附活性相關(guān)性研究

安 新，高利常，王冬梅，鄒吉敏，李 超，袁寶軍

(河北聯(lián)合大學附屬開灤醫(yī)院檢驗科，河北 唐山 063000)

1型補體受體(complement receptor 1，CR1/CD35)是紅細胞膜上主要的免疫物質(zhì)，是紅細胞有效清除免疫復合物(IC)的物質(zhì)基礎(chǔ)，參與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展，從而成為國內(nèi)外學者的研究熱點[1-4]。2型糖尿病(T2DM)是一種慢性終身性疾病。近年來發(fā)現(xiàn)T2DM患者紅細胞免疫功能低下，且與病程及并發(fā)癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[5-7]。為進一步探討T2DM與CR1基因多態(tài)性及紅細胞CR1數(shù)量、黏附活性的關(guān)系及意義，我們對T2DM患者進行了研究。

材料和方法

一、臨床資料

選擇河北聯(lián)合大學附屬開灤醫(yī)院臨床確診T2DM患者132例，均符合世界衛(wèi)生組織(WHO)1997年診斷標準，其中男63例，女69例，年齡39～82歲。正常對照組124名，來自河北聯(lián)合大學附屬開灤醫(yī)院健康體檢者，其中男66名，女58名，年齡37～79歲。2組人群均排除心腦血管、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，未曾接受改善免疫功能的治療。

二、檢測項目及方法

1.紅細胞CR1黏附活性測定 (1)血樣本處理:無菌采集所有對象清晨空腹外周血2 mL，枸櫞酸鈉抗凝，780×g離心，使紅細胞沉淀備用;(2)靶細胞配置:37℃溶解已分裝冰凍的靶細胞(腫瘤細胞)，加入1 mL生理鹽水，混勻，2100×g離心5 min，吸凈上清液(切勿吸掉細胞)，加入150 μL 生理鹽水混勻，備用;(3)加樣:取 1 μL 紅細胞和100 μL血漿加入靶細胞管，混勻，37℃水浴30 min后加200 μL緩沖液，輕輕顛倒混勻;(4)結(jié)果判斷和計數(shù):取150 μL反應(yīng)液置玻片中央，加一滴瑞姬氏染液并水平涂開，顯微鏡下計數(shù)100個靶細胞，結(jié)合5個以上紅細胞的靶細胞為一個單位，計算“黏附率”，即黏附活性。試劑盒購自解放軍302醫(yī)院檢驗中心免疫室。

2.紅細胞CR1分子定量測定 采用文獻[8]的測定方法，試劑盒購自解放軍302醫(yī)院檢驗中心免疫室。

3.CR1基因多態(tài)性測定 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)，限制性內(nèi)切酶HindⅢ酶切位點位于結(jié)構(gòu)基因內(nèi)含子。參考文獻[9]合成引物。引物 1:5'-CCT TCAATGGAATGGTGCAT-3';引物 2:5'-CCCTTG TAAGGCAAGTCTGG-3'。取待檢者抗凝血0.1 mL，用碘化鈉法提取模板DNA。PCR反應(yīng)總體積30 μL，其中模板 DNA 3 μL、引物 1 和 2 各0.4 μL、TaqDNA 聚 合 酶 0.1 μL、4 × dNTP 2.4 μL、10 × PCR buffer 3 μL，加超純水至30 μL，充分混勻后短暫離心。循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性4 min后，94 ℃ 60 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，擴增30個循環(huán)后，72℃延伸5 min。產(chǎn)物酶切:取擴增產(chǎn)物14 μL，加入內(nèi)切酶 HindⅢ 6 μL并充分混勻，置于37℃水浴2 h。將酶切產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外觀察。酶切后只出現(xiàn)1.8 kb 1條條帶的為 HH 型(高表達型)，出現(xiàn)1.8、1.3和0.5 kb 3條條帶的為HL型(中表達型)，出現(xiàn)1.3和0.5 kb 2條條帶的為LL型(低表達型)，由此計算基因型頻率和等位基因頻率。試劑盒購于解放軍302醫(yī)院檢驗中心免疫室。

三、統(tǒng)計學方法

計量資料用t檢驗，計數(shù)資料用χ2檢驗，Ρ＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、T2DM組和正常對照組紅細胞CR1數(shù)量及黏附活性變化

T2DM組紅細胞CR1數(shù)量及黏附活性均低于正常對照組(Ρ ＜0.01)，見表1。

表1 T2DM組與正常對照組紅細胞CR1數(shù)量及黏附活性比較()

表1 T2DM組與正常對照組紅細胞CR1數(shù)量及黏附活性比較()

注:與正常對照組比較，*P＜0.01

組別 例數(shù)CR1數(shù)量(3×106 RBC)CR1黏附活性T2DM 組 132 1.21 ±0.49* 44.44 ±16.54*正常對照組124 1.84 ±0.52 53.82 ±17.93

二、T2DM組和正常對照組CR1基因多態(tài)性分布

T2DM組與正常對照組CR1基因型頻率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.824，Ρ ＞0.05);T2DM 組CR1等位基因L頻率為14.8%，正常對照組等位基因L頻率為11.3%，兩者差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.3635，Ρ ＞0.05)。2 組3 種基因型頻率見表2。

表2 T2DM組與正常對照組CR1基因多態(tài)性比較[例(%)]

三、T2DM組和正常對照組CR1基因不同基因型紅細胞CR1數(shù)量及黏附活性分析

比較CR1基因HH、HL、LL 3種基因型的紅細胞CR1數(shù)量與黏附活性。T2DM組和正常對照組組內(nèi)比較，HH型紅細胞CR1數(shù)量與黏附活性雖均高于 HL型，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。LL型因樣本量小而未進行統(tǒng)計學處理。2組間同種基因型比較，T2DM組HH型、HL型紅細胞CR1數(shù)量與黏附活性均低于正常對照組(Ρ＜0.05)。見表 3。

表3 T2DM組與正常對照組CR1基因不同基因型紅細胞CR1數(shù)量及黏附活性分析()

表3 T2DM組與正常對照組CR1基因不同基因型紅細胞CR1數(shù)量及黏附活性分析()

注:與T2DM組比較，*Ρ＜0.05;與T2DM組HL型比較，#Ρ＜0.05

組 別 例數(shù)CR1數(shù)量(3×106 RBC)CR1黏附活性T2DM 組6 1.54 ±0.44 47.12 ±15.09 HH 型 100 1.32 ±0.47 47.14 ±18.24 HL 型 25 1.12 ±0.54 41.19 ±16.36 LL 型 7 0.96 ±0.49 37.12 ±17.63對照組HH 型 102 1.91 ±0.60* 60.15 ±18.26*HL 型 16 1.79 ±0.53# 52.13 ±15.46#LL型

討 論

人CR1是一種相對分子質(zhì)量為160000～250000的單鏈膜糖蛋白，廣泛分布于紅細胞和白細胞等多種細胞，且絕大多數(shù)CR1呈簇狀分布于紅細胞。每個紅細胞平均含有500個左右CR1，與年齡和性別無明顯關(guān)系[10]。CR1是補體C3b的受體，是紅細胞免疫功能的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。研究證實，紅細胞CR1有清除體內(nèi)循環(huán)免疫物，調(diào)節(jié)細胞免疫和體液免疫等功能[10-11]。T2DM患者體內(nèi)存在數(shù)量眾多的循環(huán)免疫復合物(IC)，CR1數(shù)量及黏附活性變化與病程及并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5-7]。

CR1存在于紅細胞、白細胞等多種細胞表面，但CR1基因多態(tài)性只在紅細胞上表達，這是紅細胞CR1與其他細胞CR1所不同之處[12]。人CR1為常染色體共顯性遺傳，該基因由2個復雜多樣化的等位基因構(gòu)成，位于1號染色體32區(qū)的補體激活調(diào)節(jié)子區(qū)[13-15]。根據(jù)長同源序列(LHR)轉(zhuǎn)錄本是4個還是5個LHR可分為CR1S和CR1F 2個等位基因。而決定紅細胞CR1數(shù)量表達高低的是位于LHR-D的第2個短一致重復序列(SCR)27號內(nèi)含子的點突變。由于該點突變，出現(xiàn)HindⅢ新酶切位點，表現(xiàn)為 CR1基因 HH、HL、LL 3種基因型。CR1等位基因正常為H型，突變后為L型。等位基因無HindⅢ新酶切位點，為HH型(純合子)，酶切電泳只有1.8 kb片段;HL型(雜合子)有1個HindⅢ新酶切位點，可見1.8、1.3 和0.5 kb 3 個片段;LL 型(純合子)有 2個HindⅢ新酶切位點，可見1.3和0.5 kb 2個片段。這種點突變主要由父母遺傳，但也可后天獲得[16-19]。

紅細胞表面CR1數(shù)量與其黏附活性呈明顯正相關(guān)[18]。紅細胞CR1數(shù)量的變化主要由遺傳因素即基因型決定。但在紅細胞免疫功能過程，CR1因清除IC被消耗或封閉而造成數(shù)量有所下降[20]。本研究結(jié)果顯示T2DM組和正常對照組CR1基因型頻率HH型最高、HL型次之、LL型最低，T2DM組紅細胞CR1等位基因L頻率高于對照組，但T2DM患者CR1基因型頻率和等位基因頻率與正常對照組相比并無明顯差異。而T2DM組紅細胞CR1數(shù)量及黏附活性均低于正常對照組。提示T2DM患者紅細胞CR1數(shù)量及黏附活性變化比CR1基因型頻率變化更顯著。故可將紅細胞CR1數(shù)量及黏附活性變化作為T2DM研究的重要指標。

在2組組內(nèi)對比中，CR1基因型頻率無明顯差異，紅細胞CR1數(shù)量與黏附活性HH型與HL型無明顯差異。提示T2DM患者紅細胞免疫功能的改變與CR1基因型頻率關(guān)系不密切。而組間同種基因型對比可見T2DM組HH型、HL型紅細胞CR1數(shù)量與黏附活性均低于正常對照組(Ρ＜0.05)。提示T2DM患者紅細胞免疫功能的改變與CR1基因的表達或后天獲得性因素有關(guān)。雖然CR1基因在T2DM患者和健康人群分布一致，但在mRNA水平或蛋白質(zhì)翻譯階段可能存在某種未知的調(diào)控機制，導致末端產(chǎn)物CR1分子表達水平降低，進一步影響紅細胞免疫功能?；蛘逿2DM患者處于高血糖水平，引起紅細胞膜代謝改變，造成紅細胞膜上CR1封閉或因清除IC被大量消耗而致CR1數(shù)量和黏附活性減低。本研究結(jié)果顯示T2DM患者紅細胞CR1數(shù)量及黏附活性減低，提示T2DM的發(fā)生與紅細胞免疫功能低下有關(guān)。但T2DM的發(fā)生和CR1數(shù)量及黏附活性降低之間的因果關(guān)系還需進一步研究。

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