低體積PCR擴增用于單細胞分離和檢驗

韓俊萍，李彩霞，嚴 紅，朱 典，李艮平，胡 蘭

（1.中國人民公安大學，北京 100038；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038；3.法醫(yī)遺傳學公安部重點實驗室，北京 100038；4.重慶醫(yī)科大學，重慶 400016）

低體積PCR擴增用于單細胞分離和檢驗

韓俊萍1，李彩霞2，3，嚴 紅2，朱 典4，李艮平4，胡 蘭2，3

（1.中國人民公安大學，北京 100038；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038；3.法醫(yī)遺傳學公安部重點實驗室，北京 100038；4.重慶醫(yī)科大學，重慶 400016）

目的 優(yōu)化在單細胞分離檢驗中應用0.2mL試管做低體積擴增載體的最佳反應條件。 方法 制備理想口腔上皮細胞懸液，用0.2mL試管分別收集捕獲到的5、10個細胞，設(shè)置蛋白酶K添加、PCR反應金牌酶用量、循環(huán)次數(shù)3組條件，用Identifiler?Plus試劑盒進行復合擴增，比較各組的檢出率、等位基因丟失率和非特異性擴增情況。 結(jié)果 用0.2mL試管做低體積擴增中，加蛋白酶K裂解、PCR反應金牌酶0.4μL、PCR反應32個循環(huán)，這3個條件的檢出率較高，等位基因丟失率較低。 結(jié)論 在單細胞分離檢驗中采用0.2mL試管進行低體積擴增，可以作為芯片-低體積擴增的有效補充手段。

法醫(yī)遺傳學；核酸擴增技術(shù)；單細胞

混合生物檢材的DNA分型問題是法醫(yī)實際檢案的難題之一，而近些年來發(fā)展起來的單細胞分離檢驗技術(shù)[1]是實現(xiàn)混合樣品分離檢驗的有效方法之一。有研究建立了單細胞分離檢驗技術(shù)，其中的芯片-低體積擴增技術(shù)使整個平臺的靈敏度顯著提高[2-6]。但在實際應用中發(fā)現(xiàn)，低體積擴增技術(shù)使用的擴增玻片采用開放設(shè)計的模式，對實驗環(huán)境和操作的要求較高，并且需要單獨購置擴增儀器，增加了成本，不利于該技術(shù)的推廣和應用。因此，本研究旨在探索試管中進行低體積擴增的可行性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

理想口腔拭子（健康志愿者提供）1枚。

Identifier?Plus試劑盒（含Control DNA 9947A）、9700型熱循環(huán)儀、3130型遺傳分析儀均購自美國AB公司，Olympus倒置顯微鏡、TransferMan NK2顯微操作儀、80 μm毛細管玻璃吸針均購自德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞懸液的制備

取1枚口腔拭子放入加有1mL無菌去離子水的1.5mL試管中，晃動拭子幾次，使其上的細胞充分脫落，棄去拭子，振蕩離心管，混勻液體。

1.2.2 細胞捕獲

參照文獻[4]顯微捕獲操作步驟進行細胞捕獲。

1.2.3 考察蛋白酶K的作用

取2組0.2mL試管，每組16個。第一組每管加1.2μL的滅菌水，第二組每管加1.2μL的蛋白酶K（質(zhì)量濃度為0.4mg/mL），每組均加入捕獲的細胞5、10個，各8管，以離心半徑5 cm，8 000 r/min，離心1 min，加入3.5μL礦物油。將第二組放于9700型熱循環(huán)儀在56℃ 1h、99℃ 10min條件下裂解變性。第一組不裂解。之后，2組各管均加1.2μL PCR反應液（含金牌酶0.4μL），用Identifiler?Plus試劑盒進行擴增。

擴增程序為：95℃ 11min；94℃ 20s，59℃ 3min，30個循環(huán)；60℃延伸40min；4℃保存。所有產(chǎn)物均在3130型遺傳分析儀進行檢測。每組均設(shè)有陰性和9947A陽性對照。

1.2.4 PCR反應金牌酶用量的優(yōu)化

取2組0.2mL試管，每組16個，每組均加入捕獲的細胞5、10個，各8管，加1.2μL蛋白酶K裂解，再加1.2μL PCR反應液，其中第一組含金牌酶0.2μL，第二組含金牌酶0.4μL，擴增程序及其他步驟均同上。

1.2.5 PCR循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化

取3組0.2 mL試管，每組16個，每組均加入捕獲的細胞5、10個，各8管，加1.2μL蛋白酶K裂解，再加1.2 μL PCR反應液（含金牌酶0.4 μL），第一組擴增時循環(huán)30次，第二組循環(huán)32次，第三組循環(huán)34次，其他步驟均同上。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

所得DNA檢測圖譜均與已知分型結(jié)果比對，獲得13個基因座以上正確分型且各等位基因峰高大于50RFU為有效分型結(jié)果。每個條件下的8次實驗結(jié)果按照同一基因座出現(xiàn)該峰5次以上的原則進行結(jié)果綜合，綜合結(jié)果與標準分型比對。所得數(shù)據(jù)采用四格表χ2檢驗進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白酶K對實驗結(jié)果的影響

在細胞數(shù)目相同的情況下，添加蛋白酶K的檢出率（有效分型次數(shù)/8次實驗）、非特異性擴增位點數(shù)（出現(xiàn)非特異性擴增的位點/16個位點×8次實驗）、等位基因丟失率（等位基因丟失條帶總數(shù)/預計等位基因總條帶）結(jié)果見表1。由表1可知，添加蛋白酶K的檢出率高于不加蛋白酶K，等位基因丟失率也低于后者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。5個和10個細胞的綜合結(jié)果與標準分型一致。

表1 是否加蛋白酶K的實驗結(jié)果（n=8，%）

2.2 PCR反應中金牌酶用量的優(yōu)化

當細胞數(shù)目相同時，PCR反應中金牌酶加0.4μL的非特異性擴增位點數(shù)和等位基因丟失率均低于加0.2μL，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各組的綜合結(jié)果均與標準分型一致。結(jié)果見表2。

表2 PCR反應中金牌酶不同用量的實驗結(jié)果（n=8，%）

2.3 對PCR循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化

當細胞數(shù)目相同時，3組循環(huán)數(shù)的等位基因丟失率比較，PCR循環(huán)32次等位基因丟失率明顯低于循環(huán)次數(shù)為30和34，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各組的綜合結(jié)果均與標準分型一致。結(jié)果見表3。

表3 循環(huán)次數(shù)的實驗結(jié)果 （n=8，%）

2.4 不同細胞數(shù)的檢出率和等位基因丟失率的比較

在加入蛋白酶K、PCR反應加金牌酶0.4 μL、循環(huán)次數(shù)為32的條件下，5個細胞的檢出率是75%，等位基因丟失率12.05%，10個細胞可以獲得穩(wěn)定的完整分型，二者等位基因丟失率的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

本實驗使用顯微操作方法捕獲所需數(shù)目的口腔上皮細胞，置于0.2 mL試管中，裂解時在管中加入3.5μL礦物油封閉，以防止因溫度過高蛋白酶K蒸發(fā)導致裂解不完全，同時也有效避免了DNA量的損失。實驗中除嚴格控制污染外，同時設(shè)置陰性和9947A陽性對照，結(jié)果均顯示正確，說明本實驗未受到外源性DNA的污染。

由本實驗結(jié)果可以看出，加蛋白酶K裂解的實驗組要優(yōu)于不加蛋白酶K，而且增加PCR反應液中金牌酶量以及循環(huán)次數(shù)，減少了等位基因丟失，提高檢測靈敏度。但當循環(huán)數(shù)增加至34次時，非特異性擴增增加同時等位基因丟失增多，這是由于循環(huán)數(shù)增多，小片段優(yōu)先擴增，大片段的擴增產(chǎn)物少，使得等位基因丟失反而增多，故循環(huán)數(shù)不是越多越好。常規(guī)的PCR反應體系中金牌酶加0.2 μL，本實驗中增加至0.4μL，其作用是在小體系下酶量加倍可以增大反應效率，減少等位基因片段的丟失。綜合以上3組實驗結(jié)果，優(yōu)化出2μL體系擴增條件為加蛋白酶K裂解，循環(huán)32次，反應液中金牌酶量加0.4μL。

在優(yōu)化出的實驗條件下，10個細胞的檢出率達100%，等位基因丟失率明顯低于5細胞，雖然5個細胞的檢出率達不到100%，但是綜合8次實驗的結(jié)果最終可以獲得完整的分型，因此，用試管做2 μL擴增，其靈敏度也較高，能滿足微量檢材擴增的要求。

前期研究表明，使用顯微操作技術(shù)聯(lián)合AmpliGrid芯片-低體積擴增進行單細胞分離檢驗，3個口腔上皮細胞就能得到完整的Identifiler和Minifiler這兩種試劑盒的分型圖譜[4-5]。AmpliGrid 1 μL體系顯著提高了檢測的靈敏度和檢出率，對研究微量和超微量檢材具有重要意義。但其也存在一些不足，首先AmpliGrid微量反應玻片價格昂貴，增加了檢測成本；其次，該玻片48個反應位點是開放性的，如果一次實驗未用完，第二次使用時存在污染的可能，對低體積擴增影響很大；再次，玻片上由于操作技術(shù)或其他原因在裂解和擴增時容易產(chǎn)生氣泡爆掉，最終得不到任何實驗結(jié)果，即穩(wěn)定性不太好。基于上述不足，本研究優(yōu)化了試管作為2μL擴增體系。通過實驗發(fā)現(xiàn)，該體系的靈敏度和檢出率雖然不如用芯片做低體積擴增體系高，但是其成本遠低于1μL體系，不需要額外購置擴增儀器，對操作技巧要求低，可以作為低體積擴增技術(shù)的有效補充手段之一。

[1]Findlay I，Taylor A，Quirke P，et al.DNA fingerprinting from single cells[J].Nature，1997，389（6651）：555-556.

[2]張健，胡蘭，張惠芹，等.利用LCM技術(shù)從生物檢材中提取單個細胞[J].中國人民公安大學學報（自然科學版），2005，（1）：14-17.

[3]李鑫，胡蘭，郭紅玲，等.顯微操作法提取混合斑中精子細胞方法的探討[J].中國法醫(yī)學雜志，2006，21（5）：263-265.

[4]亓冰，李彩霞，涂政，等.單細胞顯微捕獲技術(shù)聯(lián)合LVPCR系統(tǒng)在法醫(yī)學中的應用[J].國際遺傳學雜志，2009，32（2）：84-88.

[5]蘇芹，嚴紅，李彩霞，等.MiniFiler試劑盒進行微量細胞STR分型可行性探討[J].中國法醫(yī)學雜志，2008，23（5）：330-332.

[6]黃江平，李彩霞，亓冰，等.顯微捕獲技術(shù)結(jié)合低體積擴增技術(shù)在混合唾液斑檢驗中的應用[J].吉林公安高等專科學校學報，2010，（1）：49-54.

2011-12-05）

（本文編輯：李成濤）

Low Volume Amplification in Single Cell Separation and Inspection

HAN Jun-ping1,LI Cai-xia2,3,YAN Hong2,ZHU Dian4,LI Gen-ping4,HU Lan2,3
（1.Chinese People’s Public Security University,Beijing 100038,China;2.Institute of Forensic Science,Ministry of Public Security,P.R.China,Beijing 100038,China;3.Key laboratory of Forensic Genetics,Ministry of Public Security,Beijing 100038,China;4.Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China）

Objective To establish optimal amplification conditions with the application of 0.2mL test tube in single cell separation and inspection.Methods Oral epithelium cell suspension was prepared.Five or ten cells were collected with 0.2 mL test tube.Then DNA were amplified with Identifiler?Plus kit in three different conditions in which the proteinase K addition,gold enzyme concentration in PCR reaction, and PCR reaction cycles were adjusted separately.Finally the detection rate,allelic dropout rate and artificial alleles were compared among the groups.Results In these 3 different conditions：addition of proteinase K,addition of 0.4 μL gold enzyme in PCR reaction,and use of 32 cycles,the detection rate was higher and allelic dropout rate was lower than the other conditions.Conclusion In single cell separation and inspection,the usage of 0.2mL test tube could be an effective supplement to chip-low volume amplification.

forensic genetics;nucleic acid amplification techniques;single cell

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.02.012

1004-5619（2012）02-0123-03

韓俊萍（1986—），女，山西太原人，碩士研究生，主要從事法醫(yī)遺傳學研究；E-mail：pgww19861025@163.com

胡蘭，女，博士，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)遺傳學研究；E-mail：hulan328@yahoo.com