東亞飛蝗TLR9基因cDNA克隆及蛋白質(zhì)序列分析

劉迎春,聶惠蓉(福建醫(yī)科大學(xué)細胞生物學(xué)與遺傳學(xué)系，福建 福州 350004)

李裕紅(泉州師范學(xué)院生物系,福建 泉州 362000)

東亞飛蝗TLR9基因cDNA克隆及蛋白質(zhì)序列分析

劉迎春,聶惠蓉(福建醫(yī)科大學(xué)細胞生物學(xué)與遺傳學(xué)系，福建 福州 350004)

李裕紅(泉州師范學(xué)院生物系,福建 泉州 362000)

東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis)依靠先天性免疫系統(tǒng)來防御病原微生物的入侵，TLRs是天然免疫重要的病原體識別受體。在已知的東亞飛蝗TLR9受體基因(LmTLR9) 的cDNA部分序列基礎(chǔ)上，進一步獲得其序列并對其序列進行分析；觀察金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae) 的侵染對蝗蟲LmTLR9 mRNA 表達的影響。結(jié)果表明獲得的LmTLR9 cDNA序列含有1個2340bp的開放閱讀框,推定的蛋白質(zhì)序列由780個氨基酸殘基組成。與黑腹果蠅、岡比亞按蚊和致倦庫蚊的氨基酸序列同源性分別為19.0%、26.0%和26.0%；與對照組相比,侵染綠僵菌24h和48h后，試驗組東亞飛蝗中腸TLR9 mRNA 分別升高了7.17 %和4.97 %,但無顯著性差異。

東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis);Toll 樣受體9基因；序列分析

飛蝗是一種洲際性農(nóng)業(yè)重大害蟲，東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis)在我國分布面積廣，危害最為嚴重。因而加強對飛蝗等農(nóng)業(yè)害蟲的研究和災(zāi)害的綜合防治，已成為關(guān)系我國經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定的重要因素。目前，由于化學(xué)農(nóng)藥的種種弊端,利用生物殺蟲農(nóng)藥控制蝗蟲已得到廣泛認同。然而蝗蟲的免疫防御作用極大地延緩了生物殺蟲劑的殺蟲速率。蝗蟲沒有類似于T細胞和B細胞的專一獲得性免疫系統(tǒng)，先天免疫系統(tǒng)是其唯一的防御系統(tǒng)[1]。天然免疫系統(tǒng)主要分為2大類：體液免疫和細胞免疫。其中由昆蟲脂肪體合成分泌抗菌肽形成的昆蟲體液免疫最快。抗菌肽的合成由2條不同的信號通道調(diào)節(jié)：Toll信號途徑和Imd信號途徑[2]。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs) 是參與Toll途徑的主要基因產(chǎn)物，是一組與天然免疫密切相關(guān)、進化保守的受體家族。TLRs通過參與對不同病原體的PAMPs (Pathogen associated molecular pattern)進行識別，并將胞外識別信號傳遞到胞內(nèi)，這是啟動先天免疫所必需的[3]。Toll蛋白最早是在研究果蠅胚胎發(fā)育中背腹極性形成時被發(fā)現(xiàn)的，后又發(fā)現(xiàn)Toll蛋白與免疫應(yīng)答的關(guān)系。隨后在人類和其他動物中也有發(fā)現(xiàn)大量的Toll及同源蛋白，被稱為Toll樣受體(TLR)。研究表明，Toll樣受體同源分子都是Ⅰ型跨膜蛋白，它由緊密相連的3個部分組成： 胞外段是富含18～31個亮氨酸重復(fù)序列(Leucine rich repeats，LRRs)，參與對入侵病菌的PAMPs( Pathogen associated molecular pattern,PAMPs)識別；跨膜區(qū)是富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域；胞內(nèi)段與IL-1受體(Interleukin-1 receptor IL-1R)同源[3]。迄今,在果蠅中已有12種Toll受體被鑒定，在岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)、家蠶(Bombyxmori)和蜜蜂(Apismellifera)也分別有11、11和5種Toll樣受體被鑒定[4-7]。這些受體對激活宿主昆蟲的先天性免疫應(yīng)答起著十分重要的作用， 然而，目前對于蝗蟲Toll樣受體的報道,僅限于獲得部分TLR9的cDNA片段[8]。金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae) 是一類應(yīng)用廣泛的昆蟲病原真菌,在蝗蟲防治中起著重要作用[9]。目前已有報道在正常東亞飛蝗的中腸中檢測到了TLR9基因的明顯表達，但真菌的侵染是否對東亞飛蝗TLR9的表達有影響,但影響如何目前尚未見報道。為此,本研究通過已獲得的cDNA片段進一步克隆蝗蟲TLR9基因,用生物信息學(xué)方法進行了分析，并利用實時定量PCR方法研究該基因在綠僵菌侵染蝗蟲后的表達量的變化,為進一步研究蝗蟲TLR9受體在先天性免疫的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、菌株和質(zhì)粒

東亞飛蝗參照Gillespie等[10]的方法進行人工飼養(yǎng)：飼養(yǎng)溫度30℃,相對濕度75%,光照時間12h/d；大腸桿菌JM 109 購自博大派克公司；金龜子綠僵菌菌株購自上海復(fù)祥生物科技有限公司；質(zhì)粒pMD18-T購自寶生物工程有限公司。

1.1.2 主要試劑

Prime STARTMDNA Polymerase、SmartTMPCR cDNA Synthesis Kit為CLONTECH 公司產(chǎn)品； 限制性內(nèi)切酶、牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)、T4多核苷酸激酶(T4PNK) 和mRNA提取試劑盒購自Promega公司；High Pure Plasmid Isolation Kit 為Roche公司產(chǎn)品； 凝膠回收試劑盒為博亞生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品； 其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 引物設(shè)計

為獲得LmTLR9基因cDNA的5’ 端序列,采用SMART 5’-RACE 法,根據(jù)已知的cDNA片段序列設(shè)計嵌套式PCR引物T93、T94和T95。反轉(zhuǎn)錄引物T93為5’-AGGTCTTCTACTTGT-3’； 引物T94為5’-GCGCAGTCTCTTCAAGAA-3’； 引物T95為 5’-AATTGTCCAGACACCGATA -3’。

1.3 LmTLR9基因5’ 端cDNA 序列的克隆

取東亞飛蝗成蟲中腸液氮研磨至粉末狀,mRNA提取按試劑盒說明書進行。根據(jù)Genbank上已知的東亞飛蝗TLR9的部分cDNA序列(1230bp，含3’polyA),設(shè)計1條反轉(zhuǎn)錄引物T93和1對嵌套式PCR引物T94、T95,以東亞飛蝗mRNA 500ng為模板,按照5’-Full RACECore Set 描述的操作程序進行,首先以T93為反轉(zhuǎn)錄引物合成第一鏈cDNA,然后以其為模板,利用該試劑盒提供的5’PCR PrimerⅡA 和下游特異引物T94、T95,PCR 擴增出TLR9基因5’ 端cDNA 序列,然后將回收純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR在3’ 端加A,并將產(chǎn)物連接到pMD218T Vector上。按文獻采用氯化鈣法制備大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞,進行連接、轉(zhuǎn)化、陽性克隆菌株的篩選及電泳鑒定?？寺【暧缮虾angon公司進行DNA序列測定,將獲得的序列和已知的3’端cDNA序列拼接得到LmTLR9序列，并進行分析。

1.4 序列分析

用ORF Finder 軟件對克隆片段進行翻譯,用Multalin軟件進行同源性分析,用SOSUI WWW Server預(yù)測該氨基酸序列是否屬于膜蛋白。用SMART軟件分析氨基酸序列的結(jié)構(gòu)功能域，用SOPMA 程序預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)。

1.5 熒光定量PCR 檢測

取東亞飛蝗成蟲初期雄蟲，在其前胸背板用微量進樣器接種含1.0×105個綠僵菌孢子的棉籽油5μl，分別于接種后0、24、48h提取東亞飛蝗的中腸的總RNA。根據(jù)東亞飛蝗TLR9和NADH的序列設(shè)計引物T9F 5’-GGAAGATT GTGGTCATTGTAG -3’；T9R 5’-ACCACTGACTGCGAAGA -3’； NADH F 5’- T CCACCAAAGACAGCAAC- 3’ ；NADH R 5’-T ATTCGT TTATGGGTTC 3’ 。以NADH為內(nèi)參照。引物合成和測序由上海生物工程公司完成。熒光定量PCR 反應(yīng)體系如下：10× PCR Buffer 2.5μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，上、下游引物各0.5μl (10pmol/L)，模板cDNA 1.5μl，Taq 酶0.2μl(50U/μl)，10×SYBR Green Ⅰ 2.5μl,加去離子水至25μl。每個樣本設(shè)3 個反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃ 4 min；94℃ 20s，58℃ 20s，72℃ 30s，共40個循環(huán)。熒光定量PCR 結(jié)果以Ct值表示，Ct值為每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。ΔCt值為基因的平均Ct值減去內(nèi)標(biāo)基因NADH的Ct值；ΔΔCt值為不同時間樣品的ΔCt的差值；2-ΔΔCt為基因差異表達的倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列解析

圖1 東亞飛蝗TLR9結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

通過RT-PCR 和5’RACE方法克隆的東亞飛蝗TLR9基因cDNA部分序列( GenBank登錄號：JQ910652,縮寫名為LmTLR9),序列長度為2632bp。用ORF Finder對cDNA序列進行分析,該序列含有一個長2340bp的開放閱讀框,由該序列推定的蛋白質(zhì)序列由780個氨基酸殘基組成。SOSUI軟件預(yù)測東亞飛蝗TLR9受體是一個跨膜蛋白受體。根據(jù)SMART程序分析LmTLR9的氨基酸序列,LmTLR9是個3次跨膜蛋白( 圖1)，由胞外區(qū)、3個跨膜區(qū)(212～229aa，456～478aa,565～587aa)和胞內(nèi)區(qū)3部分組成。其胞外結(jié)構(gòu)域由多個串聯(lián)重復(fù)的LRR序列組成，而胞內(nèi)區(qū)含有與人白細胞介素1受體(IL-1R)高度同源的區(qū)域即TOLL/IL-1受體同源(TIR)，說明LmTLR9分子具有病原分子模式識別和信號傳導(dǎo)的作用。SOPMA 程序預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)：α 螺旋(Alpha Helix)占37.56 %，β 轉(zhuǎn)角(Beta turn)占6.28 %，20.26%的延伸鏈(Extended strand)，無規(guī)則卷曲(Random coil)占35.90% (圖2)。

圖2 東亞飛蝗TLR9二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

圖3 東亞飛蝗TLR9 基因產(chǎn)物氨基酸序列同源性預(yù)測

2.2 東亞飛蝗TLR9氨基酸序列的同源性分析

推導(dǎo)氨基酸序列比較結(jié)果表明，東亞飛蝗TLR9與黑腹果蠅(登錄號NP-649214)、岡比亞按蚊(登錄號AAL37903)和致倦庫蚊(登錄號EDS27864)的TLR9 分子同源性分別為19.0%、26.0%和26.0%。通過分析發(fā)現(xiàn)，東亞飛蝗TLR9蛋白同其他昆蟲的TLR9蛋白在受體同源區(qū)(TIR)具有較高的同源性，其他區(qū)域的同源性極低( 圖3)，表明TLR9在進化過程中保守性低。

2.3 東亞飛蝗TLR9基因的表達

熒光定量RT-PCR 方法檢測LmTLR9基因在東亞飛蝗被綠僵菌侵染0、24、48h的表達水平，結(jié)果表明侵染綠僵菌24、48h的LmTLR9基因表達量分別為對照組的107.17%和104.97%，但差異不顯著(Pgt;0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。這表明LmTLR9基因的表達量在侵染前后沒有發(fā)生顯著變化。

表1 東亞飛蝗TLR9基因的表達情況

3 討論

生物農(nóng)藥是未來農(nóng)藥發(fā)展的趨勢,蝗蟲的免疫防御反應(yīng)極大地延緩了目前使用的微生物殺蟲劑的殺蟲效率,因此,研究蝗蟲免疫應(yīng)答機制,找到免疫應(yīng)答過程中的關(guān)鍵因子并以此為靶標(biāo),篩選對這個關(guān)鍵因子有抑制、阻斷等功能的基因,對于高效殺蟲生物的篩選、改良和設(shè)計具有十分重要的應(yīng)用價值。金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae) 是一類應(yīng)用廣泛的昆蟲病原真菌,在蝗蟲防治中起著重要。在昆蟲中,對PAMPs的識別是由Toll受體介導(dǎo)的[3]。目前已發(fā)現(xiàn)的TLR家族成員至少有10種,均參與機體的固有免疫反應(yīng)。有研究表明，TLRs中以TLR2、TLR4和TLR9在抗真菌感染免疫的作用最為重要[11-14]，例如,TLR2和TLR4可識別白念珠菌和煙曲菌,TLR9也可識別煙曲菌。

本研究采用RACE等手段,分離出了東亞飛蝗TLR9基因cDNA 序列,NCBI的GenBank 登錄號為JQ910652(cDNA序列)。將LmTLR9 cDNA 序列用NCBI Blastn 工具與數(shù)據(jù)庫進行比對，除其TIR部位，其他序列同源性很低。目前昆蟲TLR9的氨基酸序列已在果蠅和蚊子中被分離鑒定出來，東亞飛蝗TLR9推導(dǎo)氨基酸序列與上述昆蟲蛋白氨基酸序列同源性變動在19%～26% 之間，同源性主要表現(xiàn)在受體同源區(qū)(TIR)。蛋白分子結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，LmTLR9是跨膜蛋白，胞外區(qū)具有LRR結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)區(qū)具有TIR結(jié)構(gòu)域，表現(xiàn)出典型的TLR家族結(jié)構(gòu)特征，表明東亞飛蝗TLR9分子具有病原分子模式識別和信號傳導(dǎo)的作用。本研究驗證了TLR9在正常東亞飛蝗中腸組織中有表達,推測這可能與中腸內(nèi)存在大量的腸道微生物菌群有關(guān)。在侵染綠僵菌24h和48h,LmTLR9 mRNA表達量沒有顯著變化,現(xiàn)已明了TLR9主要識別細菌的CpG,它是細菌DNA中以未甲基化的CpG二核苷酸為核心的特定寡核苷酸序列。筆者分析TLR9可能未能識別綠僵菌的CpG，因此沒有參與綠僵菌入侵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前東亞飛蝗其他的TLRs仍未見報道?？梢韵嘈?隨著對東亞飛蝗TLRs的研究逐漸深入,一定能對蝗蟲的防治提供詳盡理論基礎(chǔ)和技術(shù)儲備。

[1]Zheng L,Zhang L,Lin H.Toll-like receptors in invertebrate innate immunity[J].Journal of Invertebrate Survival,2005,2:105-113.

[2]Hetru C,Troxler L,Hoffmann J A.Drosophilamelanogasterantimicrobial defense [J].J Infect Dis,2003,187:327-334.

[3]Kawai A S.The role of pattern-recognition receptors in innate immunity:update on Toll-like receptors [J].Nature Immunology,2010,11:374-384.

[4]Luna C,Wang X L,Huang Y M,et al .Characterization of four Toll related genes during development and immune responses inAnophelesgambiae[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,2002,32:1171-1179.

[5]Christophides G K,Zdobnov E,Barillas-mury C,et al .Immunity-related genes and gene families inAnophelesgambiae[J ].Science,2002,298:159-165.

[6]Evans J D,Aronstein K,Imler J L.Immune Pathways and Defence Mechanisms in Honey BeesApismellifera[ J]. Insect Molecular Biology,2006,15:645-656.

[7]Cheng T C,Zhang Y C,Liu C,et al .Identification and analysis of Toll-related genes in the domesticated silkworm,Bombyxmori[J].Developmental and Comparative Immunology,2008,32:464-475.

[8]黎群英,夏玉先.東亞飛蝗Toll9受體基因及組織定位[J].西南大學(xué)學(xué)報,2008,(12):91-96.

[9]Liu Y C,Wang Z K,Yin Y P,et al.Expression,purification,and characterization of recombinantMetarhiziumanisopliaeacid trehalase inPichiapastoris[J].Protein expression and purification,2007,54:66-72.

[10]Gillespie J P,Burnett C,Chamley A K.The immune response of the desert locustSchistocercagregariaduring mycosis of the entomopathogenic fungus,Metarhiziumflavoviride.[J].Insect Physiol,2000,46:429-437.

[11]Blanco J L,Garcia M E.Immune response to fungal infections[J].Vet Immunol Immunopathol,2008，9:47-70.

[12]Netea M G,Ferwerda G,Van der Graaf,C A A,et al.Recognition of fungal pathogens by Toll-like receptors[J].Curr Pharm Des,2006,12:4195-4201.

[13]Meier A,Kirschning C J,Nikolaus T,et al.Toll-like receptor (TLR) and TLR4 are essential forAspergillusinduced activation of murine macrophages[J].Cell Microbiol.,2003,5:569-570.

[14]Nakamura K,Miyazato A,Xiao G,et al.Deoxynucleic acids fromCryptococcusneoformansactivate myeloid dendritic cells via a TLR9-dependent pathway[J].J Immunol,2008,180:4067-4074.

Q78

A

1673-1409(2012)06-S018-04

2012-06-10

福建省自然科學(xué)基金項目(2009J05068)；福建醫(yī)科大學(xué)博士啟動基金項目(2009BS002)

劉迎春(1974-)，女，福建福鼎人，博士，副教授，研究方向為生物醫(yī)學(xué)工程。

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.06.005