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    內(nèi)生拮抗菌Bacillus subtilis QZ-7抗茄子黃萎病研究

    2012-11-17 05:22:02楊廷憲孫正祥長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院湖北荊州434025

    程 磊,楊廷憲,楊 佩,孫正祥,周 燚(長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北 荊州 434025)

    內(nèi)生拮抗菌BacillussubtilisQZ-7抗茄子黃萎病研究

    程 磊,楊廷憲,楊 佩,孫正祥,周 燚(長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北 荊州 434025)

    從開花期茄子的根內(nèi)分離到對茄子黃萎病菌具有強(qiáng)烈抑制活性的拮抗菌株BacillussubtilisQZ-7,其抑菌帶寬達(dá)26.60mm。定殖試驗(yàn)表明,QZ-7菌株能有效定殖于茄子根內(nèi),并能在茄子根際存活并保持較高菌量。對茄子種子萌發(fā)和幼苗生長影響試驗(yàn)表明,該菌株可促進(jìn)種子萌發(fā),并具有明顯促進(jìn)莖伸長生長的作用。室內(nèi)盆栽試驗(yàn)表明,單個(gè)菌株對茄子黃萎病的防效可達(dá)86%,且持效期較長。這些結(jié)果表明,QZ-7具有進(jìn)一步研究開發(fā)的價(jià)值。

    茄子黃萎??;枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) ;定殖;防效

    黃萎病是一種世界性的土傳維管束病害,由輪枝菌屬大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb)引起,俗稱半邊瘋、黑心病,是威脅茄子生產(chǎn)的重要病害之一,對茄子產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響。該病原菌可以微菌核的形式在植物衰老組織中存活數(shù)年并保持侵染能力[1],在土壤中能存活14a或更長時(shí)間[2]。目前該病害的抗病品種缺乏[3]、化學(xué)農(nóng)藥防效不佳。

    黃萎病這類病害一直是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的難點(diǎn)?,F(xiàn)在主要采取水旱輪作方式來控制該病害的發(fā)生,但由于水資源的限制,這一措施難以大面積推廣實(shí)施。因此,生物防治成為防治此類病害的重要措施,特別是植物內(nèi)生菌,能高效定殖于植物體內(nèi)、占據(jù)有利生態(tài)位、兼具促生和其他功能,將防治在植物土傳和維管束病害方面具有很強(qiáng)的應(yīng)用前景。

    本研究旨在從生物防治角度出發(fā),從茄子根內(nèi)根部篩選能定殖于茄子體內(nèi)、對黃萎病菌具有很強(qiáng)拮抗作用的優(yōu)勢內(nèi)生菌株,來防治茄子黃萎病。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)菌種與培養(yǎng)基

    茄子黃萎病原菌:由長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供;PSA培養(yǎng)基:用于病原菌培養(yǎng)。

    篩選培養(yǎng)基:分別稱取新鮮茄子根100g、蔗糖5g、蛋白胨5g、酵母浸出粉2g和瓊脂15g,然后將100g茄子根用適量水煮沸10min,過濾,取過濾液,將蛋白胨、蔗糖和酵母浸出粉溶解,將溶液煮沸,加入瓊脂,完全溶解后定容至1000ml,調(diào)節(jié)pH 6.5~7.0,分裝,121℃高壓蒸汽滅菌,用于培養(yǎng)和篩選芽孢桿菌。

    1.2 拮抗細(xì)菌的分離

    在茄子開花期,選擇茄子黃萎病發(fā)生嚴(yán)重的田塊,挑選長勢好的健康茄子植株(植株莖稈切面無變褐現(xiàn)象,周圍其他植株發(fā)病嚴(yán)重),取其主要根部及其相連部分莖,去皮,用自來水洗凈,在超凈工作臺(tái)上,用75%酒精消毒5min,再用0.1%升汞消毒2mim,滅菌水漂洗3次后剪碎,25℃下,滅菌水浸泡剪碎物24h(使維管束中的內(nèi)生菌充分游離出來),于80℃恒溫水浴鍋中處理20min(除去非芽孢桿菌細(xì)菌),取液體30μl涂平板,25℃恒溫培養(yǎng),待菌落長出,挑選芽孢桿菌及類似菌菌落,進(jìn)行抑菌活性檢測。

    1.3 拮抗細(xì)菌的活性檢測

    初篩:用移液槍將茄子黃萎病原菌種子液轉(zhuǎn)接到裝有30ml PSA液體培養(yǎng)基的三角瓶(100ml)中, 25℃、150r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)48h,制得病原菌溶液;將PSA培養(yǎng)基熔化,待其溫度降到50℃時(shí),用移液槍吸取1ml病原菌溶液,注入到50℃PSA培養(yǎng)基(200ml)中,混勻,倒平板,得到含病原菌平板。將分離所得的芽孢桿菌類似菌編號(hào),于含病原菌的培養(yǎng)基上劃線,置25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h,選擇周圍具有明顯抑菌圈的拮抗細(xì)菌。

    復(fù)篩:如前所述制備含茄子黃萎菌孢子的平板,在平板中用打孔器打直徑5mm的4個(gè)孔(3個(gè)孔做處理,1個(gè)孔做對照)用少許融化培養(yǎng)基封住孔底。將初篩的生防菌在篩選培養(yǎng)基(液體)中培養(yǎng)48h,將發(fā)酵液4℃、12000 r/min離心20min,取上清液,經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后,吸取100μl過濾液注入待測平板孔里,以滅菌水為對照,每處理重復(fù)3次,以抑菌圈半徑大小判定生防菌株的抑菌活性強(qiáng)弱,篩選抑菌能力強(qiáng)的菌株。

    1.4 生防菌16S rDNA測序

    利用PCR擴(kuò)增生防菌的16S rDNA序列。選用E.coli16S rDNA通用上游引物: 5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (E.coli16S rDNA bases 9~27) ;下游引物: 5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’(E.coli16S rDNA bases 1525~1542)。PCR產(chǎn)物純化后與pMD-18T載體連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,挑選陽性克隆進(jìn)行序列分析。

    1.5 拮抗細(xì)菌對茄子萌發(fā)、幼苗生長的影響

    將拮抗細(xì)菌液體發(fā)酵24h,用發(fā)酵液浸泡茄子種子1d(對照用自來水浸泡1d),在培養(yǎng)皿內(nèi)放2張濾紙,加無菌水保濕,將浸泡后的種子轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿內(nèi),25℃恒溫培養(yǎng),觀察種子萌發(fā)及生長情況。

    將茄子地土壤(土壤為黑棕壤:有機(jī)質(zhì)1.20%,堿解氮116.8mg/kg,速效磷10.4mg/kg,速效鉀140.5mg/kg,含水量42%,pH 6.8)取回,121℃高壓蒸汽滅菌,待冷卻后將拮抗細(xì)菌發(fā)酵液與土壤混合,分裝于換盆中,3次重復(fù),將茄子播種于花盆內(nèi),以不加拮抗細(xì)菌的為對照,5d后記錄出芽率,30d比較根系生長情況。

    1.6 拮抗菌定殖試驗(yàn)

    將茄子地土壤(土壤為黑棕壤:有機(jī)質(zhì)1.20%,氮116.8mg/kg,速效磷10.4mg/kg,速效鉀140.5 mg/kg,含水量42%,pH 6.8)滅菌,裝于缽中(每缽裝2.5kg土壤),每缽播5粒茄子種子(三月茄),在光照12h、28℃、濕度80%和黑暗12h、24℃條件下濕度80%條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待茄子苗長至2~3心葉時(shí)用拮抗菌液接種:將已做標(biāo)記的QZ-7配制成1×108cfu /ml菌液,分別澆灌于茄子根部(每株澆菌液10ml),以不接菌的為對照,每個(gè)處理5缽,共50株茄子苗。

    在處理后的15、30、45、60、75d測定菌株的定殖力。取植株主要根部及近地莖桿(根莖交界處到子葉著生處之間),去皮,分別稱重,表面消毒,剪碎,于25℃下用10ml無菌水浸泡24h后,取浸泡液稀釋后涂平板(含氨芐西林200μg/ml),計(jì)算茄子維管束中菌數(shù)量。

    1.7 盆栽防治試驗(yàn)

    將茄子地土壤(土壤為黑棕壤:有機(jī)質(zhì)0.9%,氮112.8mg/kg,速效磷10.2mg/kg,速效鉀139.5mg/kg,含水量50%,pH 6.9)、營養(yǎng)土,按50∶50(質(zhì)量比)比例混合,再與拮抗細(xì)菌(液體發(fā)酵24h,1×108cfu/ml,按1ml/kg混合)和黃萎病菌(50cfu/ml孢子懸浮液,按1ml/kg混合)混合,分裝于花盆中,以不接黃萎病菌的為對照,每缽播種10粒種子,每處理5次重復(fù),在光照12h、28℃、濕度80%和黑暗12h、24℃條件下濕度80%條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),處理如下:(1) QZ-7發(fā)酵液,1×108cfu/ml; (2)對照:清水處理。在澆灌后30d、45d和60d調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)。

    防效=[(對照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對照組病情指數(shù)]×100%;

    病情指數(shù)=[∑(病級(jí)株數(shù)×代表數(shù)值)×總株數(shù)×發(fā)病最重級(jí)的代表數(shù)值]×100。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 拮抗細(xì)菌的分離與鑒定

    圖1 QZ-7對茄子黃萎病菌的抑制作用

    經(jīng)分離純化后共得到210株細(xì)菌菌株。采用平板劃線對峙法初篩得到18株活性較強(qiáng)的茄子黃萎病拮抗菌株,編號(hào)QZ-1、QZ-2、QZ-3、……、QZ-18。復(fù)篩結(jié)果顯示,菌株QZ-7的抑菌效果最佳,抑菌帶寬達(dá)26.60mm(打孔器直徑為5mm)以上,而對照幾乎不表現(xiàn)出抑菌活性(圖1)。

    在此基礎(chǔ)上,利用PCR技術(shù)對菌株QZ-7的16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增,與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源比較,發(fā)現(xiàn)它與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)A23菌株的16S rDNA序列(GenBank: AB526464.1)有極高的同源性,相似性高達(dá)99%,初步把該菌株命名為枯草芽孢桿菌QZ-7。

    2.2 拮抗細(xì)菌對茄種子萌發(fā)、幼苗生長的影響

    結(jié)果表明,經(jīng)QZ-7菌株處理后的茄種子和對照的出芽率沒有明顯區(qū)別,均在80%左右,但在出芽和生長速度方面有明顯區(qū)別。經(jīng)QZ-7菌株處理后的茄種子在第3d均開始出芽,而對照未出芽;在第5d時(shí),QZ-7菌株處理后的種子幼苗根系比對照明顯伸長,最長可達(dá)44mm,下胚軸長15~20mm,而對照第5d開始出芽,根長僅5mm,上胚軸伸長不明顯(圖2、圖3)。

    圖2 QZ?7對茄子種子發(fā)芽的影響

    圖3 QZ?7處理5d后茄子幼苗根系長度和下胚軸長度

    經(jīng)QZ-7處理后種于花盆中,30d其長勢旺于對照,植株高度明顯高于對照(圖4),植株莖直徑也大于對照,但根系不及對照發(fā)達(dá)(圖5)。

    圖4 QZ-7對茄子生長長勢的影響

    圖5 QZ-7對茄子根系的影響

    2.3拮抗菌在茄子根際的定殖情況

    圖6 QZ-7菌株在茄子根際的定殖情況

    定殖試驗(yàn)表明,在經(jīng)標(biāo)記過的QZ-7灌根的茄子根部維管束中均分離出了帶標(biāo)記的拮抗細(xì)菌:處理后10d分離出了QZ-7,之后其含量呈上升趨勢,在30d左右達(dá)到高峰(3.1×105 cfu/g),之后出現(xiàn)下降趨勢,在40d和50d其含量相當(dāng) (圖6)。

    2.5盆栽防治情況

    盆栽防治試驗(yàn)結(jié)果顯示:(1)從時(shí)間上看,經(jīng)QZ-7處理后的茄子發(fā)病率和病情指數(shù)一直保持較低水平,而對照的發(fā)病率和病情指數(shù)都相對較高;(2)QZ-7處理后,其防效可以達(dá)到86%以上,隨著茄子苗的生長,病害發(fā)生率和病情指數(shù)均保持穩(wěn)定,而對照有不斷加劇的趨勢(表1)。

    表1 QZ-7對茄子黃萎病的室內(nèi)防治試驗(yàn)結(jié)果

    3 討論

    植物內(nèi)生菌是一個(gè)多樣性的特殊微生物類群,受到研究者的高度關(guān)注,因?yàn)橹参飪?nèi)生菌占據(jù)植物體內(nèi)有利的生態(tài)位,具有生物防治、促進(jìn)植物生長、增強(qiáng)宿主抗逆境、抗病蟲害、抗菌、抗病毒和抗腫瘤活性等優(yōu)點(diǎn)[4-6]。本研究從茄子根莖維管束內(nèi)篩選得到抑菌活性較強(qiáng)的菌株QZ-7,在PSA平板上對茄子黃萎病的抑菌帶寬度均可達(dá)26.6mm(打孔器直徑5mm)以上,說明該菌株的抑菌活性很強(qiáng),同時(shí)QZ-7菌株對茄子具有較強(qiáng)的促生作用。

    QZ-7在茄子的根際定殖結(jié)果表明,該菌株能長時(shí)間有效地定殖于茄子根際,而在不同的時(shí)間段,QZ-7菌株在茄子根部的種群含量是波動(dòng)的,這可能是因?yàn)橹参镌诓煌纳?,其體內(nèi)物質(zhì)是變化的,導(dǎo)致菌群的種群結(jié)構(gòu)也發(fā)生相應(yīng)的變化。

    盆栽試驗(yàn)表明,QZ-7對茄子黃萎病具有很高的防效(86%以上),隨著時(shí)間的推移,經(jīng)處理過的茄子病情指數(shù)有小幅下降趨勢,說明這些菌株還對作物具有一定的治療作用。

    因此,該菌株是一株能有效定殖于茄子根部,并且能長時(shí)間存活于田間土壤的細(xì)菌,在抗茄子黃萎病方面具有很好的應(yīng)用潛力。

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    S476:S435.621

    A

    1673-1409(2012)06-S001-04

    2012-06-10

    湖北省教育廳重大項(xiàng)目 (Z20091201);國家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(091048922)。

    程 磊(1987-),男,安徽阜陽人,現(xiàn)從事植物保護(hù)研究。

    周 燚,E-mailyiyizhzh@yahoo.com.cn。

    10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.06.001

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