二、三線抗結(jié)核藥體外相互作用研究

趙偉杰（北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所/首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院，北京 1 0 1 1 4 9）

二、三線抗結(jié)核藥體外相互作用研究

趙偉杰＊（北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所/首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院，北京 1 0 1 1 4 9）

目的：研究1 0種二、三線抗結(jié)核藥兩兩聯(lián)用對結(jié)核分枝桿菌標準株H3 7 Rv的體外相互作用，為臨床耐多藥結(jié)核的治療提供參考。方法：采用微孔板阿爾瑪藍指示劑法測定不同濃度莫西沙星（MFX）、左氧氟沙星（LFX）、克拉霉素（CLR）、對氨基水楊酸（PAS）、阿米卡星（AK）、丙硫異煙胺（PTO）、卷曲霉素（CPM）、氯法齊明（CFZ）、對氨基水楊酸異煙肼（PI）、阿莫西林/克拉維酸（AC）共1 0種二、三線抗結(jié)核藥單獨及兩兩聯(lián)用對H3 7 Rv標準株的最低抑菌濃度（MIC），計算分級抑菌濃度（FIC）比以評價各藥間的相互作用。結(jié)果：FIC值在0.2 5～0.5之間的有1 4種藥物組合，屬協(xié)同作用；FIC值在0.5 6 2 5～0.7 5的有1 8種藥物組合，屬部分協(xié)同作用；FIC值在0.7 6～1的有1種藥物組合，屬相加作用；FIC值在1～4的有7種藥物組合，屬無關作用。結(jié)論：二、三線抗結(jié)核藥并不是都適合兩兩聯(lián)用，應根據(jù)具體情況制訂治療方案。

抗結(jié)核藥；相互作用；分級抑菌濃度比；兩兩聯(lián)用

結(jié)核病是長期危害人類健康的慢性傳染病，耐多藥結(jié)核（MDR-TB，即至少同時對利福平和異煙肼耐藥的菌株）是結(jié)核病的嚴重類型，其病程遷延、治療效果差、治愈率低。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估算，全球每年MDR-TB的發(fā)病人數(shù)約3 0～6 0萬，實際MDR-TB患者可能接近1 0 0萬[1]，而中國的MDRTB患者占全球的1/4～1/3[2]，MDR-TB已經(jīng)成為全球結(jié)核病控制面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。但3 0多年來，尚未出現(xiàn)一種全新結(jié)構(gòu)和作用機制的抗結(jié)核藥，而二、三線藥較低的治療效果和較高的副作用又是不爭的事實。因此，在現(xiàn)有的條件下，有必要探求二、三線抗結(jié)核藥在MDR-TB治療方案中的合理聯(lián)用，以提高療效、降低毒性。本文研究了1 0種國內(nèi)常用的二、三線抗結(jié)核藥兩兩聯(lián)用對結(jié)核分枝桿菌標準株H3 7 Rv的體外相互作用，為臨床MDR-TB的治療提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）。

1.2 試藥

莫西沙星（MFX，注射劑，德國拜耳公司，批號：BXCE0 G3，規(guī)格：0.4 g·2 5 0 mL－1）；左氧氟沙星（LFX，標準品，批號：0 0 0 1 4 2 5 5 0 7，純度：≥9 8%）、丙硫異煙胺（PTO，標準品，批號：1 2 7 K1 3 2 4）、卷曲霉素（CPM，標準品，批號：0 1 8 K1 0 6 8）購自美國Sigma公司；克拉霉素（CLR，原料藥，浙江華義醫(yī)藥有限公司，批號：2 0 1 0 0 4 0 1 8 9，純度：≥9 7%）；對氨基水楊酸（PAS，注射用粉末，哈藥集團制藥總廠，批號：B1 0 0 1 0 0 8 1 7，規(guī)格：每支2 g）；阿米卡星（AK，注射劑，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號：0 9 0 2 1 0，規(guī)格：0.2 g·2 mL－1）；對氨基水楊酸異煙肼（PI，原料藥，重慶華邦制藥有限公司，批號：2 0 0 5 0 3 1 9，純度：≥9 7%）；阿莫西林/克拉維酸（AC，注射用粉末，華北制藥有限公司，批號：F0 9 1 0 1 0 2，規(guī)格：每支1.2g）；氯法齊明（CFZ，原料藥，南京立業(yè)制藥有限公司，批號：1 0 0 3 0 8 1，純度：≥9 8%）；7 H9培養(yǎng)基（美國Difico公司）；白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶（ADC，西班牙Becton Dickinson S.A.公司）；阿爾瑪藍試劑（英國Setotec公司）；吐溫8 0為化學純。

1.3 菌株

H3 7 Rv標準株（ATCC 2 7 2 9 4），由國家參比實驗室提供（購自美國模式培養(yǎng)物集存庫），北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所藥物研究室保存。

2 方法

2.1 溶液的制備

LFX、CLR、PTO、CFZ以二甲基亞砜（DMSO）分別溶解制成濃度為1.0、3.2、1.0、1.9 2 mg·mL－1的初溶液；CPM、PI以滅菌蒸餾水分別溶解制成濃度為2 5.6、2.0 mg·mL－1的初溶液，用0.2 2 μm膜過濾滅菌；PAS、AC以滅菌蒸餾水分別制成濃度為2 0 0、1 0 0 mg·mL－1的初溶液；MFX、AK以注射劑（濃度分別為1.6、1 0 0 mg·mL－1）作為初溶液。以上各藥初溶液以7 H9培養(yǎng)基稀釋為作用濃度，具體作用濃度見表1。

表1 10種抗結(jié)核藥的作用濃度Tab 1 The effect concentrations of 10anti-tuberculosis drugs

2.2 菌株的培養(yǎng)與混懸液的制備

H3 7 Rv標準株接種于7 H9培養(yǎng)基（含0.0 5%吐溫8 0，1 0%ADC）中，接種濃度為1 04cfu·mL－1，置于3 7℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2周，至濁度為McFarland 1（麥氏比濁管1，相當于1 07cfu·mL－1）時，以新鮮的7 H9培養(yǎng)基（含1 0%ADC）稀釋為1 06cfu·mL－1的菌懸液。

2.3 藥物單用試驗

檢測1 0種抗結(jié)核藥單用對H3 7 Rv菌懸液的最低抑菌濃度（MIC），并設不含藥物的菌液生長對照孔和不含藥物與菌液的空白對照孔。方法如下：9 6孔無菌微孔板加入含各藥4種濃度的培養(yǎng)基1 0 0 μL（生長對照孔加入1 0 0 μL不含藥的培養(yǎng)基，空白對照孔加入2 0 0 μL不含藥的培養(yǎng)基），加入1 0 0 μL“2.2”項下制備的H3 7 Rv菌懸液（菌的終濃度為5×1 05cfu·mL－1）（空白對照孔不加菌液），置于3 7℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d；第7天加入2 0 μL阿爾瑪藍試劑和5 0 μL 5%吐溫8 0，3 7℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 4 h，記錄各孔顏色。藍色表示無生長，粉紅色表示有生長，將阻止顏色改變（從藍色變?yōu)榉奂t色）的最低藥物濃度定義為MIC。

2.4 藥物的相互作用試驗

兩藥間的相互作用以棋盤試驗法完成[3～5]，具體操作：將1 0種抗結(jié)核藥可以同時使用的4個濃度均兩兩（2種藥物分別以a、b表示）聯(lián)合（依據(jù)合理用藥原則，試驗中排除了同類藥物（LFX與MFX）之間，注射劑（PAS、AK、CPM）之間，PAS與PI之間的兩兩聯(lián)合）加入至9 6孔無菌微孔板，每個濃度5 0 μL，然后加入1 0 0μL“2.2”項下制備的H3 7 Rv菌懸液，其余操作同“2.3”項下，檢測MIC。藥物聯(lián)合應用數(shù)據(jù)的評價以分級抑菌濃度比（FIC）表示：FIC＝（MICa聯(lián)合/MICa單獨）+（MICb聯(lián)合/MICb單獨）。評價標準為：FIC值≤0.5為協(xié)同作用；0.5＜FIC值≤0.7 5為部分協(xié)同作用；0.7 6＜FIC值≤1為相加作用；1＜FIC值≤4為無關作用；FIC值＞4為拮抗作用。

3 結(jié)果

3.1 藥物單用的MIC

1 0種抗結(jié)核藥單用時對H3 7 Rv標準菌的MIC分別為：MFX 0.1 2 5μg·mL－1、LFX 0.5μg·mL－1、CLR 4.0μg·mL－1、PAS 0.2 5μg·mL－1、AK 1.0μg·mL－1、PTO 2.0μg·mL－1、CFZ 0.2 4μg·mL－1、CPM 2μg·mL－1、PI 0.1μg·mL－1、AC 1 6μg·mL－1。

3.2 藥物聯(lián)用的MIC

結(jié)果顯示，F(xiàn)IC值在0.2 5～0.5之間的有1 4種藥物組合，屬協(xié)同作用；FIC值在0.5 6 2 5～0.7 5的有1 8種藥物組合，屬部分協(xié)同作用；FIC值在0.7 6～1的有1種藥物組合，屬相加作用；FIC值在1～4的有7種藥物組合，屬無關作用。1 0種抗結(jié)核藥物兩兩聯(lián)用對H3 7 Rv標準菌的抑菌作用見表2。

表2 10種抗結(jié)核藥兩兩聯(lián)用對H37Rv標準菌的抑菌作用Tab 2 Inhibitory effect of two-drug therapy of 10 anti-tuberculosis drugs against H37Rv

4 討論

結(jié)核分枝桿菌的藥敏試驗一般需要3～4周，本試驗運用阿爾瑪藍指示劑（通常用于指示細胞的生長或存活）法[6]，僅需1周左右即可出結(jié)果，且具有高通量、準確、經(jīng)濟等特點。運用傳統(tǒng)的試管二倍稀釋法，完成1 0種藥物的兩兩聯(lián)合的相互作用試驗，工作量極大；而采用結(jié)核菌快速培養(yǎng)儀（BACTEC）檢測，不但儀器昂貴，且測試費用亦遠高于阿爾瑪藍指示劑法。

MDR-TB治療中，有關二、三線抗結(jié)核藥對結(jié)核分支桿菌的相互作用還未見文獻報道。因國內(nèi)沒有MDR-TB標準株，所以筆者測定了國內(nèi)常用的1 0種二、三線抗結(jié)核藥對H3 7 Rv標準株的MIC及兩兩聯(lián)用的FIC值，筆者將在以后的工作中補充對MDR-TB分支桿菌臨床分離株的藥物相互作用研究。

綜上，二、三線抗結(jié)核藥并不是都適合兩兩聯(lián)用，應根據(jù)具體情況制訂治療方案。

[1] Blower SM，Chou T.Modeling the emergence of the“hot zone”：tuberculosis and the amplification dynamics of drug resistance[J].Nature Medicine，2 0 0 4，1 0（1 0）：1 1 1 1.

[2] 徐 瑛.耐多藥結(jié)核病研究進展[J].預防醫(yī)學情報雜志，2 0 0 8，2 4（4）：2 0 9.

[3] Kim ES，Jeong SI，Kim JH，et al.Synergistic effects of the combination of 2 0-hydroxyecdysone with ampicillin and gentamicin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].J Microbiol Biotechnol，2 0 0 9，1 9（1 2）：1 5 7 6.

[4] Choi JG，Kang OH，Lee YS，et al.In vitro activity of methyl gallate isolated from galla rhois alone and in combination with ciprofloxacin against clinical isolates of salmonella[J].J Microbiol Biotechnol，2 0 0 8，1 8（1 1）：1 8 4 8.

[5] De Logu A，Onnis V，Saddi B，et al.Activity of a new class of isonicotinoylhydrazones used alone and in combination with isoniazid，rifampicin，ethambutol，para-aminosalicylic acid and clofazimine against Mycobacterium tuberculosis[J].J Antimicrob Chemother，2 0 0 2，4 9（2）：2 7 5.

[6] 陸 宇，王 斌，鄭梅琴，等.應用Alamar Blue和MTT測定抗結(jié)核藥物最低抑菌濃度的研究[J].中國防癆雜志，2 0 0 7，2 9（6）：4 9 9.

Study the Interactions of Second or Third Line Anti-tuberculosis Drugs in Vitro

ZHAO Wei-jie
（Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute/Beijing Chest Hospital，Capital Medical University，Beijing 1 0 1 1 4 9，China）

OBJECTIVE：To study the interactions of two-drug selected from 1 0second or third line anti-tuberculosis drugs to the mycobacterium tuberculosis H3 7 Rv in vitro，and to provide reference for the treatment of multidrug-resistance tuberculosis.METHODS：Alamar blue susceptibility test was used to determinate the MICs of 1 0drugs used alone and some two-drug use to H3 7 Rv.These 1 0drugs included moxifloxacin（MFX），levofloxacin（LFX），clarithromycin（CLR），para-aminosalicylic acid（PAS），amikacin（AK），protionamide（PTO），capreomycin（CPM），clofazimine（CFZ），pasiniazid（PI）and amoxicillin/clavulanic acid（AC）.The fractional inhibitory concentration（FIC）ratio of these combinations was calculated to evaluate the interactions of those drugs.RESULTS：There were 1 4combinations whose FIC ratio between 0.2 5～0.5belonging to the synergy；1 8combinations whose FIC ratio between 0.5 6 25～0.7 5belonged to partial synergy；one combinations whose FIC ratio between 0.7 6～1belonged to additive effect；7combinations whose FIC ratio between 1～4belonged to indifference.CONCLUSION：Not all second or third line anti-tuberculosis drugs are suitable for two-drug therapy.We should formulate therapeutic scheme according to the condition.

Anti-tuberculosis drugs；Interaction；Fractional inhibitory concentration ratio；Two-drug therapy

R9 6 9.2

A

1 0 0 1-0 4 0 8（2 0 1 2）2 9-2 7 1 6-0 3

DOI1 0.6 0 3 9/j.issn.1 0 0 1-0 4 0 8.2 0 1 2.2 9.1 0

＊副研究員。研究方向：抗結(jié)核藥的藥效學及藥動學。電話：0 1 0-8 9 5 0 9 3 5 8。E-mail：zhaoweijie0 4 1 5@yahoo.cn

2 0 1 1-0 8-1 0

2 0 1 1-1 0-1 4）

＊副主任護師。研究方向：靜脈藥物配置及合理用藥。E-mail：hdfywxh@sina.com