羥基喜樹堿緩釋片對(duì)大鼠的腦組織毒性及骨髓抑制作用研究

唐華非，劉松青，楊波，李飛，馮華

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院，重慶4 0 0 0 3 8；2.解放軍第3 0 5醫(yī)院藥局，北京 1 0 0 0 1 7）

羥基喜樹堿緩釋片對(duì)大鼠的腦組織毒性及骨髓抑制作用研究

唐華非1，2＊，劉松青1#，楊波1，李飛1，馮華1

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院，重慶4 0 0 0 3 8；2.解放軍第3 0 5醫(yī)院藥局，北京 1 0 0 0 1 7）

目的：研究羥基喜樹堿（HCPT）緩釋片對(duì)大鼠的腦組織毒性及骨髓抑制作用。方法：將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組和低、中、高劑量（HCPT∶聚乳酸（PLA）分別為1∶1 0、1∶5、1∶1）HCPT組，每組1 2只，HCPT組腦內(nèi)植入相應(yīng)規(guī)格的HCPT緩釋片1片，假手術(shù)組行假手術(shù)模擬機(jī)械損傷。術(shù)后3 0 d分別采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察各組大鼠腦組織病理變化；尼氏染色觀察神經(jīng)元活性；原位末端標(biāo)記試劑盒（TUNEL）染色觀察神經(jīng)元凋亡情況；瑞氏染色觀察骨髓抑制情況。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，其余各組大鼠腦組織均有不同程度的損傷，受損部位均出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生，神經(jīng)元凋亡明顯（P＜0.0 1），但均未見發(fā)生骨髓抑制。與假手術(shù)組比較，中、高劑量HCPT組腦組織受損部位出現(xiàn)纖維化及壞死現(xiàn)象，神經(jīng)元活性降低，神經(jīng)元凋亡明顯（P均＜0.0 1），低劑量HCPT組上述指標(biāo)均無明顯變化。結(jié)論：腦內(nèi)植入HCPT緩釋片對(duì)大鼠腦組織具有一定程度的毒性，但未引起骨髓抑制。

羥基喜樹堿緩釋片；大鼠；腦組織；骨髓抑制；神經(jīng)元

近年來，間質(zhì)化療在腦膠質(zhì)瘤治療領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注[1]，即將化療藥物包裹在可生物降解的多聚體材料內(nèi)，通過藥物擴(kuò)散和聚合物骨架的降解作用控制藥物釋放速度[2]，局部植入治療，不僅可使化療藥物避開血腦屏障，而且使藥物直接作用于腦腫瘤組織，減少了對(duì)全身正常組織的毒性作用。局部緩控釋藥物間質(zhì)化療的研究，開辟了腫瘤治療的新途徑。腦植入劑是腦部間質(zhì)化療的一種新型制劑，臨床研究證實(shí)[1]，該方法可顯著提高腫瘤患者的生存期而不增加藥物毒性作用。

本課題組前期采用聚乳酸（Polylactic acid，PLA）為緩釋材料，研制了羥基喜樹堿（Hydroxycamptothecin，HCPT）緩釋片[3]，并對(duì)其治療大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)X膠質(zhì)瘤的療效進(jìn)行了研究，顯示HCPT緩釋片腦內(nèi)植入治療能明顯延長(zhǎng)荷瘤大鼠的生存期[4]。本文通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，旨在考察HCPT緩釋片對(duì)腦組織的損傷程度及骨髓抑制作用，以綜合評(píng)價(jià)HCPT緩釋片的毒性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TP1 4 0 0實(shí)驗(yàn)型單沖壓片機(jī)（上海沃迪機(jī)械有限公司）；石蠟包埋儀、石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）。

1.2 試藥

HCPT原料藥（四川廣瀚生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：0 6 0 9 0 1，純度：≥9 8%）；PLA（山東省醫(yī)療器械研究所，批號(hào)：0 6 0 5 0 1）；HCPT緩釋片（第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥學(xué)部自制，直徑：3 mm，厚度：2 mm）；多聚甲醛、tritonX-1 0 0（美國(guó)Sigma公司）；戊巴比妥鈉（上海過望化工有限公司，批號(hào)：8 0-0 6-0 3）；蘇木素-伊紅（HE）染液、尼氏（Nissl）染液（上海Beyotime公司）；原位末端標(biāo)記試劑盒（TUNEL，德國(guó)Roche公司）；瑞氏（Wright’s）染液（南京建成生物工程研究所）。

1.3 動(dòng)物

成年SD大鼠，♂，體重2 0 0～2 3 0 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（軍）2 0 0 2-0 0 7。

2 方法

2.1 HCPT緩釋片的制備[3]

按不同質(zhì)量比分別稱取HCPT和PLA適量，混勻，過8 0目篩，用單沖壓片機(jī)壓制成片劑，60Co照射滅菌后備用。

2.2 分組與給藥

將6 0只大鼠隨機(jī)均分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組和低、中、高劑量HCPT組（HCPT∶PLA分別為1∶1 0、1∶5、1∶1），如實(shí)驗(yàn)過程中大鼠死亡，需重新補(bǔ)充，以保證每組1 2只大鼠。各劑量HCPT組大鼠采用3%戊巴比妥鈉4 0 mg·kg－1腹腔注射進(jìn)行麻醉，立體定向儀固定大鼠頭部，無菌開顱，冠狀縫前3 mm、矢狀縫右側(cè)3.5 mm為中心，開直徑為3 mm的骨窗[5]，切開硬膜，取60Co照射滅菌的HCPT緩釋片植入腦皮層下1 mm，縫合，肌肉注射適量青霉素。假手術(shù)組采用同樣方法開顱，模擬緩釋片機(jī)械損傷，剪去一定大小的皮質(zhì)后，縫合，肌肉注射適量青霉素。正常對(duì)照組不作任何處理。

2.3 一般情況觀察

術(shù)后進(jìn)行大鼠體征、體重變化以及生存期觀察。以3 0 d為一個(gè)周期。

2.4 標(biāo)本取材與檢測(cè)

術(shù)后3 0 d，分別取每組大鼠6只，麻醉，4%多聚甲醛全身灌注，取大腦，去除緩釋片殘片，生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，1 0%福爾馬林溶液固定保存。各組大鼠大腦分別進(jìn)行HE染色觀察腦組織病理學(xué)變化；尼氏染色觀察神經(jīng)元尼氏體受染情況（在生理情況下，尼氏體大且數(shù)量多，反映神經(jīng)元活性強(qiáng)；在神經(jīng)元受損時(shí)，尼氏體數(shù)量減少甚至消失）；TUNEL染色觀察神經(jīng)元凋亡情況（棕色為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，藍(lán)色為被蘇木素染色的細(xì)胞核；在×2 0 0鏡下隨機(jī)選取1 0個(gè)視野，對(duì)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)大腦皮層神經(jīng)元的凋亡率）。另取每組剩余6只大鼠的股骨骨髓，涂片后進(jìn)行瑞氏染色，光鏡下觀察骨髓粒細(xì)胞、紅細(xì)胞比例，判斷是否發(fā)生骨髓抑制：成熟紅細(xì)胞呈桔紅色；中性粒細(xì)胞呈藍(lán)紫色至紫紅色；嗜酸性粒細(xì)胞呈鮮紅至桔紅；嗜堿性粒細(xì)胞呈深藍(lán)色；淋巴細(xì)胞核呈深藍(lán)紫色，其胞質(zhì)呈天藍(lán)色；單核細(xì)胞核呈淺紫色，其胞質(zhì)呈灰藍(lán)色。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用x ±s表示，采用隨機(jī)區(qū)組的方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)整理，應(yīng)用SPSS 1 3.0軟件進(jìn)行處理。P＜0.0 5表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察結(jié)果

術(shù)后4 h，大鼠均出現(xiàn)豎毛現(xiàn)象，呼吸幅度加深，活動(dòng)量減少，運(yùn)動(dòng)遲緩，警覺性降低，口、鼻、眼分泌物增多；與假手術(shù)組比較，HCPT組大鼠偶見軀體抽搐。術(shù)后1 d，大鼠均能正常飲食，以上癥狀有所緩解。術(shù)后3 d，與正常對(duì)照組比較，手術(shù)后大鼠體重均有所下降。術(shù)后5 d，大鼠運(yùn)動(dòng)、飲食等行為與正常對(duì)照組差異不明顯，行為能力測(cè)試結(jié)果差異不顯著。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠均未發(fā)生非處死性死亡。

3.2 腦組織病理學(xué)變化

與正常對(duì)照組相比，其余各組大鼠腦組織均有不同程度的損傷，受損部位均出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生。與假手術(shù)組比較，低劑量HCPT組腦組織的損傷未見明顯病理學(xué)變化，而中、高劑量HCPT組腦組織的損傷可見明顯病理學(xué)變化，受損部位出現(xiàn)纖維化及壞死現(xiàn)象。各組大鼠腦組織病理學(xué)變化見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理學(xué)變化圖（HE，×10 0）A.正常對(duì)照組；B.假手術(shù)組；C.低劑量HCPT組；D.中劑量HCPT組；E.高劑量HCPT組Tab 1 Pathological changes of cerebral tissue in of rats each group（HE，×10 0）A.normal control group；B.sham-operation group；C.HCPT low-dose group；D.HCPT medium-dose group；E.HCPT high-dose group

3.3 神經(jīng)元活性情況

與假手術(shù)組比較，低劑量HCPT組術(shù)后大腦皮層神經(jīng)元數(shù)量、形態(tài)和活性在組織結(jié)構(gòu)上差異不顯著；中劑量HCPT組神經(jīng)元數(shù)量有一定的減少，胞體內(nèi)尼氏體的數(shù)量有所減少，說明神經(jīng)元的活性降低；高劑量HCPT組神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，胞體內(nèi)尼氏體大量減少，說明神經(jīng)元活性明顯降低。各組大鼠腦組織神經(jīng)元活性情況見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織神經(jīng)元活性情況（Nissl，×40 0）A.正常對(duì)照組；B.假手術(shù)組；C.低劑量HCPT組；D.中劑量HCPT組；E.高劑量HCPT組Fig 2 Activity of neuron in cerebral tissue of rats in each grou（pNissl，×40 0）A.normal control group；B.sham-operation group；C.HCPT low-dose group；D.HCPT medium-dose group；E.HCPT high-dose group

3.4 神經(jīng)元凋亡情況

與正常對(duì)照組比較，其余各組大鼠神經(jīng)元凋亡率均明顯增加（P＜0.0 1）。與假手術(shù)組比較，低劑量HCPT組神經(jīng)元凋亡率無明顯變化（P＞0.0 5），中、高劑量HCPT組神經(jīng)元凋亡率明顯增加（P＜0.0 1）。各組大鼠神經(jīng)元凋亡率比較見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)元凋亡率比較（x ±s，n＝10）Fig 1 Comparison of neuronal apoptosis of rats in each grou（px ±s，n＝10）

3.5 骨髓抑制作用

與正常對(duì)照組比較，各劑量HCPT組骨髓粒細(xì)胞和紅細(xì)胞比例均無明顯變化，表明未發(fā)生骨髓抑制。各組大鼠股骨骨髓抑制情況見圖3（成熟紅細(xì)胞為結(jié)紅色；中性粒細(xì)胞顏色最深，數(shù)量較多；嗜酸性粒細(xì)胞體積是成熟紅細(xì)胞2倍，數(shù)量較少；嗜堿性粒細(xì)胞核形狀不規(guī)則，數(shù)量較少）。

圖3 各組大鼠股骨骨髓抑制情況（瑞氏染色，×40 0）A.正常對(duì)照組；B.低劑量HCPT組；C.中劑量HCPT組；D.高劑量HCPT組Fig 3 Femoral bone marrow suppression of rats in each group（Wright’s staining，×40 0）A.normal control group；B.HCPT low-dose group；C.HCPT mediumdose group；D.HCPT high-dose group

4 討論

PLA作為腦植入載體，對(duì)體外培養(yǎng)的大腦皮層神經(jīng)元抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用不顯著，對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)組織無明顯毒性[6]，故本實(shí)驗(yàn)未設(shè)立空白片組。

3個(gè)劑量HCPT組緩釋片植入腦內(nèi)后，對(duì)植入部位腦組織均具有一定的損傷，受損程度均高于假手術(shù)組，損傷部位出現(xiàn)了大量膠質(zhì)細(xì)胞增生，中劑量HCPT組和高劑量HCPT組甚至出現(xiàn)局部腦組織壞死。與正常對(duì)照組比較，低劑量和中劑量HCPT組中，手術(shù)對(duì)側(cè)腦組織未見病理學(xué)改變，神經(jīng)元的數(shù)量和功能未出現(xiàn)顯著變化；高劑量HCPT組手術(shù)對(duì)側(cè)腦組織也僅出現(xiàn)了輕微的噬神經(jīng)現(xiàn)象和輕度腦水腫現(xiàn)象。其原因除藥物因素所致?lián)p傷外，可能還與緩釋片骨架材料PLA代謝過程中產(chǎn)生的部分碎片有關(guān)[7]。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察，中劑量HCPT緩釋片植入腦內(nèi)后，致腦組織和神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度更接近于高劑量HCPT組。這是由于緩釋片中的藥物并非瞬間釋放，而是一個(gè)緩慢釋放的過程，此過程中腦組織中的藥物濃度保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。Storm等[8]認(rèn)為緩釋片是在藥物與腦組織接觸的界面達(dá)到最大濃度，引起細(xì)胞毒性。所以當(dāng)藥物劑量達(dá)到一定值時(shí)，緩釋片對(duì)腦組織毒性增大的程度變得緩慢。

本研究初步證實(shí)本課題組研制的HCPT緩釋片未出現(xiàn)骨髓抑制，可能與血腦屏障有關(guān)；對(duì)腦組織有一定的毒性，且隨HCPT劑量的增加，毒性增大?？蛇M(jìn)一步對(duì)HCPT緩釋片進(jìn)行優(yōu)化，以期在實(shí)現(xiàn)治療效果的同時(shí)，最大程度地降低毒性。

[1] Inoue T，Yamashita Y，Nishihara M，et al.Therapeutic efficacy of a polymeric micellar doxorubicin infused by convection-enhanced delivery againstintracranial9 L brain tumor models[J].Neuro Oncol，2 0 0 9，1 1（2）：1 5 1.

[2] Hong MH，Zhu SJ，Jiang YY，et al.Efficient tumor targeting of hydroxycamptothecin loaded PEGylated niosomes modified with transferrin[J].J Control Release，2 0 0 9，1 3 3（2）：9 6.

[3] 胡 婧，劉松青.HCPT緩釋片的制備以及處方優(yōu)化研究[J].中國(guó)藥房，2 0 0 9，2 0（2 2）：1 7 3 1.

[4] 胡 婧，劉松青.羥基喜樹堿緩釋片瘤內(nèi)植入對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤模型大鼠的腫瘤抑制作用研究[J].中國(guó)藥房，2 0 1 1，2 2（9）：8 1 8.

[5] Darice YW，Scott JH，Paul HK，et al.Poly（e-caprolactone）and poly（L-lactic-co-glycolic acid）degradable polymer sponges attenuate astrocyte response and lesion growth in acute traumatic brain injury[J].Tissue Engineering，2 0 0 7，1 3（1 0）：2 5 1 5.

[6] 唐華非，劉松青，李 飛，等.聚乳酸作為腦植入劑載體的安全性初步研究[J].中國(guó)藥房，2 0 1 0，2 1（1 3）：1 1 6 5.

[7] Suganuma J，Alexander HD.Biological response of intramedullary bone to poly-L-lactic acid[J].J Appl Biomater，1 9 9 3，4（1）：1 3.

[8] Storm PB，Moriarity JL，Tyler B，et al.Polymer delivery of camptothecin against 9 L gliosarcoma：release，distribution，and efficacy[J].J Neuro Oncol，2 0 0 2，5 6（3）：2 0 9.

Study on the Effects of HCPT Sustained-release Tablets on Cerebral Tissue Toxicity and Bone Marrow Suppression of Rats

TANG Hua-fei，LIU Song-qing，YANG Bo，LI Fei，F(xiàn)ENG Hua（Southwest Hospital，The Third Military Medical University，Chongqing 4 0 0 0 3 8，China）
TANG Hua-fei（Dept.of Pharmacy，No.3 0 5Hospital of PLA，Beijing 1 0 0 0 1 7，China）

OBJECTIVE：To study the brain tissue toxicity and bone marrow suppression of HCPT sustained-release tablets in rats.METHODS：Rats were divided into normal control group，sham-operation group，HCPT low-dose（HCPT∶PLA＝1∶1 0），medium-dose（HCPT∶PLA＝1∶5）and high-dose（HCPT∶PLA＝1∶1）groups with 1 2rats in each group.Different specifications of a HCPT sustained-release tablet were implanted into rat brain of HCPT groups.Stimulated mechanical injury was induced in sham-operation group.Animal specimens were collected 3 0days after operation.HE staining was used to observe the pathological changes of cerebral tissue，Nissl staining for observation of the activity of neuron，and TUNEL for observation of apoptosis of neuron.The myelosuppression were observed with Wright’s staining.RESULTS：Compared with normal control group，different degree of cerebral injury had been observed in other groups，the colloid cells of injured site proliferated，and obvious cell apoptosis was found（P＜0.0 1），but no myelosuppression appeared.Compared with sham-operation group，the injured site of cerebral tissue in HCPT medium-dose and high-dose groups appeared fibration，necrosis，decreased of neuronal activity and significant neuronal apoptosis（all P＜0.0 1），while the brain tissue of HCPT low-dose group had no pathological changes.CONCLUSION：The brain tissue has a certain degree of toxicity after the tablets implanted into animals.But bone marrow suppression doesn’t appear.

HCPT sustained-release tablets；Rats；Cerebral tissue；Bone marrow suppression；Neurons

R9 6 5；R9 7 9.1；R9 4 4.9

A

1 0 0 1-0 4 0 8（2 0 1 2）2 9-2 7 1 0-0 3

DOI1 0.6 0 3 9/j.issn.1 0 0 1-0 4 0 8.2 0 1 2.2 9.0 8

2 0 1 1-0 8-0 5

2 0 1 2-0 5-1 8）