戊地昔布聯(lián)合阿霉素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制研究Δ

劉煥龍，康寧，李軍霞，陳雪彥，張志清#

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊0 5 0 0 0 0；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，石家莊 0 5 0 0 1 7）

戊地昔布聯(lián)合阿霉素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制研究Δ

劉煥龍1＊，康寧1，李軍霞2，陳雪彥2，張志清1#

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊0 5 0 0 0 0；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，石家莊 0 5 0 0 1 7）

目的：研究戊地昔布聯(lián)合阿霉素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）增殖的抑制作用及其機(jī)制。方法：將人MCF-7細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、阿霉素（0.2 5 mg·L－1）組、戊地昔布（2 5、5 0、1 0 0 μmol·L－1）組及聯(lián)用組（阿霉素0.2 5 mg·L－1+戊地昔布2 5、5 0、1 0 0 μmol·L－1），加入相應(yīng)藥物繼續(xù)培養(yǎng)，檢測(cè)培養(yǎng)2 4、4 8、7 2 h（n＝6）后各組人MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率；檢測(cè)戊地昔布2 5 μmol·L－1時(shí)培養(yǎng)4 8 h后各組細(xì)胞周期和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）蛋白、細(xì)胞周期蛋白（Cyclin D1）及環(huán)氧酶2（COX-2）蛋白表達(dá)。結(jié)果：與溶劑對(duì)照組比較，除戊地昔布2 5 μmol·L－1培養(yǎng)2 4 h外，阿霉素組、戊地昔布組及聯(lián)用組增殖抑制率均明顯增加（P均＜0.0 1），且呈濃度、時(shí)間依賴性；與阿霉素組和戊地昔布組比較，聯(lián)用組增殖抑制率均明顯增加（P均＜0.0 1）。戊地昔布組細(xì)胞阻滯于G0/G1期，S期細(xì)胞比例明顯減少（P＜0.0 5）；聯(lián)用組細(xì)胞阻滯于G0/G1期和G2/M期。與溶劑對(duì)照組比較，戊地昔布組、阿霉素組及聯(lián)用組PCNA、Cyclin D1蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.0 5或P＜0.0 1），僅戊地昔布組和聯(lián)用組COX-2蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.0 5或P＜0.0 1）。結(jié)論：戊地昔布與阿霉素聯(lián)用具有協(xié)同抑制人MCF-7細(xì)胞增殖的作用，可能與抑制Cyclin D1和PCNA蛋白表達(dá)從而阻滯細(xì)胞周期有關(guān)。

人乳腺癌細(xì)胞；戊地昔布；阿霉素；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期

乳腺癌是婦女常見(jiàn)的惡性腫瘤，其治療方法目前仍以化療為主。經(jīng)典的化療藥物包括蒽環(huán)類抗菌藥物，如阿霉素等，但阿霉素等化療藥物抗腫瘤的同時(shí)可誘導(dǎo)腫瘤組織環(huán)氧酶2（COX-2）表達(dá)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。因此，COX-2抑制劑有望增強(qiáng)阿霉素等藥物的抗腫瘤作用、減輕毒性，此聯(lián)合用藥方案可能突破乳腺癌等腫瘤治療的瓶頸。COX-2在腫瘤形成過(guò)程中有重要的作用，不僅促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，也促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[1]。戊地昔布是第2代選擇性COX-2抑制劑，對(duì)COX-2的選擇性高，所致胃腸道等不良反應(yīng)發(fā)生率低。前期研究[2，3]發(fā)現(xiàn)，戊地昔布對(duì)人胃癌BGC 2 8 2 3細(xì)胞生長(zhǎng)及Lewis腫瘤有明顯的抑制作用，但其能否抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、與阿霉素聯(lián)用是否有協(xié)同作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察戊地昔布聯(lián)合阿霉素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）的增殖抑制作用，并探討其可能的機(jī)制，為乳腺癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

凝膠成像儀（美國(guó)Thermo Forma公司）；Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulte公司）。

1.2 試藥

戊地昔布原料藥（河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院制備，純度：9 9%）；注射用阿霉素滅菌粉末（浙江海正藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1 0 1 0 0 2，規(guī)格：每支1 0 mg）；MTT（德國(guó)Serva公司）；抗增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）抗體、COX-2抗體及β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Crutz公司；辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記的二抗（美國(guó)KPL公司）。

1.3 細(xì)胞

人MCF-7細(xì)胞株，由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將人MCF-7細(xì)胞置于含1 0%胎牛血清的RPMI 1 6 4 0培養(yǎng)液中，于3 7℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。0.2 5%的胰蛋白酶消化，每2～3 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備合適密度的細(xì)胞懸液，接種于9 6孔板或培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，按分組加入相應(yīng)藥物后繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以5×1 04個(gè)/孔接種于9 6孔板上，每孔0.2 mL。待細(xì)胞貼壁6 h后，輕輕吸去上清液，按空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、阿霉素（0.2 5mg·L－1）組、戊地昔布（2 5、5 0、1 0 0 μmol·L－1）組及聯(lián)用（阿霉素0.2 5mg·L－1+戊地昔布2 5、5 0、1 0 0 μmol·L－1）組，加入相應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)，除空白對(duì)照組外其余各組為試驗(yàn)組。于培養(yǎng)后2 4、4 8、7 2 h（n＝6）每孔分別加入MTT溶液（5 g·L－1）2 0 μL，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后吸棄上清液，加入二甲基亞砜2 0 0μL溶解紫色結(jié)晶，室溫震蕩1 0 min，置自動(dòng)酶標(biāo)儀上于5 7 0 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度OD值。并通過(guò)下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：增殖抑制率（%）＝（空白對(duì)照組OD值－試驗(yàn)組OD值）/空白對(duì)照組OD值×1 0 0%。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化

取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞以合適密度接種于培養(yǎng)瓶中，待貼壁后隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組、阿霉素組（0.2 5 mg·L－1）、戊地昔布組（2 5 μmol·L－1）及聯(lián)用組，加入相應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)4 8 h，消化，離心，收集細(xì)胞于離心管，再用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次（每次1 0 0 0 r·min－1離心1 0 min），收集并調(diào)整細(xì)胞為1×1 06個(gè)/mL，用7 0%的冷乙醇固定，4℃貯存。染色前用PBS洗去固定液，加1 0 0 μL RNA酶（5 0 mg·L－1），3 7℃水浴3 0 min，再加入4 0 0 μL碘化丙啶（1 0 μg·L－1）染色混勻，4℃避光3 0 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。計(jì)算機(jī)處理并分析細(xì)胞增殖周期中G0/G1、S和G2/M期細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

2.4 Western blot法檢測(cè)PCNA、Cyclin D1及COX-2蛋白表達(dá)

細(xì)胞按“2.3”項(xiàng)下方法分組，各組細(xì)胞經(jīng)藥物處理4 8 h后，收集細(xì)胞，PBS洗2次，加入RIPA細(xì)胞裂解液，超聲2 min，冰上放置1 h，使細(xì)胞充分裂解，采用二喹啉甲酸（BCA）法進(jìn)行蛋白定量。等量蛋白（2 0 μg）上樣，SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（4℃、2 h），室溫下用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h，加入一抗（PCNA、Cyclin D1、COX-2抗體），4℃孵育過(guò)夜，次日TBST洗膜3次，每次1 0 min，然后加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗，3 7℃孵育1 h。TBST洗膜3次，底物顯色。凝膠成像儀照相，以β-actin為對(duì)照，測(cè)定灰度值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 1 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，采用單因素方差分析，Dunnet t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0.0 5表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞增殖抑制率

空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組人MCF-7細(xì)胞體外生長(zhǎng)良好，2組OD值無(wú)明顯差異。與溶劑對(duì)照組比較，除戊地昔布2 5 μmol·L－1培養(yǎng)2 4 h外，阿霉素組、戊地昔布組及聯(lián)用組增殖抑制率均明顯增加（P均＜0.0 1），且呈濃度、時(shí)間依賴性；與阿霉素組和戊地昔布組比較，聯(lián)用組增殖抑制率均明顯增加（P均＜0.0 1）。各組人MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率比較詳見(jiàn)表1。

表1 各組人MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率比較（n＝6）Tab 1 Comparison of inhibition rates of human MCF-7 cells proliferation in each group（n＝6）

3.2 細(xì)胞周期

戊地昔布組作用于人MCF-7細(xì)胞可使細(xì)胞阻滯于G0/G1期，而S期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.0 5），但對(duì)G2/M期細(xì)胞比例無(wú)明顯影響。阿霉素組作用于人MCF-7細(xì)胞可使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，S期細(xì)胞比例也顯著降低（P＜0.0 1），但對(duì)G0/G1期細(xì)胞比例無(wú)明顯影響。聯(lián)用組G0/G1期和G2/M期細(xì)胞比例與溶劑對(duì)照組相比均明顯增加（P＜0.0 1），S期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.0 1）。各組人MCF-7細(xì)胞周期分布情況見(jiàn)表2。

3.3 PCNA、Cyclin D1和COX-2蛋白表達(dá)

PCNA、Cyclin D1和COX-2蛋白在溶劑對(duì)照組人MCF-7細(xì)胞中均高表達(dá)。與溶劑對(duì)照組比較，戊地昔布組、阿霉素組及聯(lián)用組PCNA、Cyclin D1蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.0 5或P＜0.0 1），僅戊地昔布組和聯(lián)用組COX-2蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.0 5或P＜0.0 1）。各組人MCF-7細(xì)胞Cyclin D1、PCNA和COX-2蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖1，柱狀圖見(jiàn)圖2。

表2 各組人MCF-7細(xì)胞周期分布情況（x±s，n＝6）Tab 2 Distribution of cell cycle of human MCF-7 cells in each grou（px±s，n＝6）

圖1 各組人MCF-7細(xì)胞PCNA、Cyclin D1和COX-2蛋白表達(dá)情況Fig 1 Protein expressions of PCNA，Cyclin D1 and COX-2 in human MCF-7cells of each group

圖2 各組人MCF-7細(xì)胞PCNA、Cyclin D1和COX-2蛋白表達(dá)柱狀圖與溶劑對(duì)照組比較：＊P＜0.0 5，＊＊P＜0.0 1Fig 2 Histogram of protein expressions of PCNA，Cyclin D1and COX-2in human MCF-7cells of each group vs.solvent control group：＊P＜0.0 5，＊＊P＜0.0 1

4 討論

研究表明，COX-2參與了許多惡性腫瘤包括乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，涉及腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移以及血管生成[4]。選擇性COX-2抑制劑可抑制胃腸道、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡。本研究結(jié)果表明，戊地昔布可顯著抑制人MCF-7細(xì)胞的增殖，且抑制率具有一定的濃度和時(shí)間依賴性。不同濃度的戊地昔布和阿霉素聯(lián)用具有協(xié)同抑制人MCF-7細(xì)胞增殖的作用，表明戊地昔布可促進(jìn)阿霉素的抗腫瘤作用。

腫瘤細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期密切相關(guān)，包括G1-S-G2-M 4個(gè)時(shí)相，其中G1-S和G2-M 2個(gè)轉(zhuǎn)變點(diǎn)是細(xì)胞周期啟動(dòng)的關(guān)鍵[5]。調(diào)節(jié)細(xì)胞周期是抗腫瘤治療的新途徑，為進(jìn)一步探討戊地昔布與阿霉素的協(xié)同作用機(jī)制，本研究采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了細(xì)胞周期進(jìn)展。結(jié)果表明，戊地昔布單藥作用于人MCF-7細(xì)胞可使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，而S期細(xì)胞比例顯著減少；阿霉素是細(xì)胞周期非特異性藥物，通過(guò)將腫瘤細(xì)胞阻滯于G2/M期而發(fā)揮其直接殺傷作用[6]，本研究結(jié)果也證明了這一點(diǎn)；聯(lián)用組G0/G1期和G2/M期細(xì)胞比例與溶劑對(duì)照組相比均明顯增加，S期細(xì)胞比例顯著減少，說(shuō)明兩藥聯(lián)用對(duì)細(xì)胞周期有協(xié)同阻滯作用，提示戊地昔布和阿霉素聯(lián)用對(duì)人MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用與抑制細(xì)胞周期進(jìn)展有關(guān)。本研究還在基因和蛋白水平上探討了兩藥對(duì)PCNA、Cyclin D1、COX-2蛋白表達(dá)的影響。PCNA是分子量為3 6 kD的核蛋白，在G1期和S早期誘導(dǎo)合成，對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控有重要作用[7]。Cyclin D1作為細(xì)胞周期的啟動(dòng)因子，推動(dòng)了細(xì)胞周期G1期的進(jìn)程，如抑制Cyclin D1的活性，細(xì)胞便無(wú)法進(jìn)入S期[8]。本研究結(jié)果表明，戊地昔布和阿霉素單獨(dú)用藥均明顯降低人MCF-7細(xì)胞PCNA和Cyclin D1的蛋白表達(dá)，聯(lián)用后抑制蛋白表達(dá)作用更為明顯，顯著降低了腫瘤細(xì)胞的增殖作用。同時(shí)也檢測(cè)了戊地昔布對(duì)人MCF-7細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果表明戊地昔布能明顯抑制COX-2蛋白表達(dá)，說(shuō)明其抑制人MCF-7細(xì)胞增殖作用可能與抑制COX-2表達(dá)、降低前列腺素E2（PGE2）生成有關(guān)。

總之，戊地昔布與阿霉素聯(lián)用具有協(xié)同抑制人MCF-7細(xì)胞增殖的作用，可能與抑制Cyclin D1和PCNA蛋白表達(dá)從而阻滯細(xì)胞周期有關(guān)。

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Inhibitory Effects of Valdecoxib Combined with Adriamycin on Proliferation of Human MCF-7 Cells and Its Mechanism

LIU Huan-long，KANG Ning，ZHANG Zhi-qing
（Dept.of Pharmacy，The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 0 5 0 0 0 0，China）
LI Jun-xia，CHEN Xue-yan（Pharmacology Teaching and Research Section，Hebei Medical University，Shijiazhuang 0 5 0 0 1 7，China）

OBJECTIVE：To study the inhibition effects of valdecoxib combined with adriamycin on the proliferation of human MCF-7cells and its mechanism.METHODS：Human MCF-7cells were randomly divided into blank control group，solvent control group，adriamycin group（0.2 5mg·L－1），valdecoxib group（2 5，5 0，1 0 0μmol·L－1）and combination group（adriamycin 0.2 5mg·L－1+valdecoxib 2 5，5 0，1 0 0μmol·L－1）.The inhibition rates of human MCF-7cell proliferation were determined 2 4，4 8，7 2h after treated with relevant medicine（n＝6）.Cell cycle，the protein expressions of PCNA，Cyclin D1and COX-2in various groups were detected 4 8h after cultured in valdecoxib 2 5μmol·L－1.RESULTS：Compared with sdvent control group，the inhibition rate of cell proliferation was increased significantly in adriamycin group，valdecoxib group and combination group，except for culture of valdecoxib 2 5μmol·L－1for 2 4h（all P＜0.0 1），in concentration and time-dependant manner； compared with adriamycin group and valdecoxib group，the inhibition rate of cell proliferation was increased significantly in combination group（all P＜0.0 1）.Valdecoxib markedly blocked the MCF-7cell progression by arresting the cells in the G0/G1phase，and the percentage of cells in S phase decreased dramatically（P＜0.0 5）；and valdecoxib combined with adriamycin blocked the MCF-7cell progression by arresting the cells in G0/G1and G2/M phase（P＜0.0 5）.Compared with solvent control group，the protein expressions of PCNA and Cyclin D1in valdecoxib group，adriamycin group and combination group were decreased significantly（P＜0.0 5or P＜0.0 1），while the protein expression of COX-2in valdecoxib group and combination group decreased significantly（P＜0.0 5or P＜0.0 1）.CONCLUSION：Valdecoxib synchronized with adriamycin can inhibit the proliferation of human MCF-7cells significantly，which may be associated with the inhibition of Cyclin D1and PCNA expression and the blockage of cell cycle.

Human MCF-7cells；Valdecoxib；Adriamycin；Cell proliferation；Cell cycle

R9 6 5

A

1 0 0 1-0 4 0 8（2 0 1 2）2 9-2 7 0 5-0 3

DOI1 0.6 0 3 9/j.issn.1 0 0 1-0 4 0 8.2 0 1 2.2 9.0 6

Δ河北省2 0 0 9年醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目（2 0 0 9 0 3 5 8）

＊副主任藥師，碩士。研究方向：腫瘤藥理學(xué)。E-mail：lhlong0 9 0 4@1 6 3.com

#通訊作者：主任藥師，博士。研究方向：臨床藥學(xué)、藥理學(xué)和新型藥物制劑。E-mail：zhangzhq@medmail.com.cn

2 0 1 1-0 8-1 5

2 0 1 1-1 0-1 1）