過度訓(xùn)練對大鼠骨骼肌炎性因子和氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響

肖衛(wèi)華陳佩杰 朱琳

1上海體育學(xué)院運(yùn)動科學(xué)學(xué)院（上海200438）

2湘南學(xué)院體育系 3廣州體育學(xué)院運(yùn)動與健康系

骨骼肌功能狀態(tài)是決定運(yùn)動成績的關(guān)鍵因素之一，而骨骼肌炎癥水平是影響骨骼肌功能狀態(tài)的重要方面。骨骼肌細(xì)胞及骨骼肌中的免疫細(xì)胞可產(chǎn)生多種促炎因子和抑炎因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素 1β（IL-1β）、白介素 10（IL-10）、受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子（Regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES）等。 TNF-α 和 IL-1β 是典型的促炎因子，而IL-10是一種多功能、多細(xì)胞源性的抗炎細(xì)胞因子，在抑制炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，大鼠以60%最大攝氧量強(qiáng)度進(jìn)行8周有氧運(yùn)動，可顯著降低骨骼肌中TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白含量[1]。離心運(yùn)動則可引起骨骼肌中IL-1β蛋白含量升高，離心運(yùn)動引起骨骼肌損傷可能與IL-1β積聚有關(guān)[2]。但過度訓(xùn)練如何影響上述因子表達(dá)，仍不得而知。RANTES是一種典型的C-C亞族成員趨化性細(xì)胞因子，具有強(qiáng)大的誘導(dǎo)白細(xì)胞向炎癥部位浸潤的能力， 還能活化白細(xì)胞從而誘導(dǎo)炎癥[3]。RANTES表達(dá)水平增加與多種炎性疾病相關(guān)[4]，其表達(dá)水平升高是炎癥反應(yīng)的特征之一[5]。但運(yùn)動如何影響骨骼肌RANTES表達(dá)的研究較少，特別是過度訓(xùn)練如何影響RANTES表達(dá)，未見相關(guān)報道。

除炎癥水平能影響骨骼肌功能狀態(tài)外，氧化應(yīng)激水平也是影響骨骼肌功能的重要因素。NADPH氧化酶可介導(dǎo)產(chǎn)生活性氧（ROS），從而加劇組織的氧化應(yīng)激水平，而gp91phox是NADPH氧化酶的關(guān)鍵催化亞基，因此 gp91phox 常被作為組織氧化狀態(tài)的指標(biāo)[6，7]。運(yùn)動特別是過度訓(xùn)練如何影響骨骼肌gp91phox表達(dá)，仍不夠清楚。因此，本研究通過建立過度訓(xùn)練模型，對過度訓(xùn)練大鼠腓腸肌炎性因子及氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行了考察，為運(yùn)動訓(xùn)練特別是加深對過度訓(xùn)練的認(rèn)識提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

8周齡健康雄性Wistar大鼠26只，購于上海實驗動物中心。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±2）℃，相對濕度50%～70%，每天光照時間為12 h，自由飲食。將大鼠隨機(jī)分為安靜對照組（C，n=10）、過度訓(xùn)練后36 h取材組（E1，n=8）和過度訓(xùn)練后 7天取材組（E2，n=8）。

1.2 過度訓(xùn)練方案

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，過度運(yùn)動組開始進(jìn)行遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練（DSPT-202跑臺，中國杭州段氏制作公司），每周6次，周日休息，共訓(xùn)練11周。過度訓(xùn)練方案參考文獻(xiàn)方法[8，9]并略作修改（表1）。

1.3 取材

于訓(xùn)練后相應(yīng)時間點 （C組取材時間同E1組）斷頭處死大鼠，并分離右后肢腓腸肌，儲存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄

在腓腸肌肌腹中點處剪取約60 mg組織，剪碎后加入1 ml Trizol（Invitrogen公司），用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（JY92-Ⅱ，寧波新芝科器研究所）粉碎，靜置10分鐘后，加入200 μl氯仿并上下顛倒充分混勻，靜置5分鐘使明顯分層，12000轉(zhuǎn)，4℃離心15分鐘，小心吸取500 μl上清入一新離心管，加入等量異丙醇，顛倒混勻并靜置10分鐘，冷凍離心機(jī)（centrifuge 5417R，德國Eppendorf公司）中12000轉(zhuǎn)，4℃離心10分鐘，白色沉淀即為RNA，用75%酒精洗滌2次后，加入30 μl DEPC水溶解。測OD值，OD260/280為 1.8～2.0的樣品可用，取 2 μg總 RNA，按 Fermentas公司第一鏈cDNA合成試劑盒說明，用梯度PCR儀（Mastercycler EP，德國 Eppendorf公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，20 μl體系。 合成的 cDNA 儲存在-20℃?zhèn)溆肹10]。

表1 大鼠過度訓(xùn)練方案

1.5 熒光定量PCR

目的基因引物來自文獻(xiàn)[11，12]或由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計并合成，β-actin做內(nèi)參基因，熒光定量引物見表2。使用定量PCR儀（Rotor-Gene 3000，Corbett Reseach） 進(jìn)行擴(kuò)增，SYBR Green試劑盒購自Fermentas公司。所有樣本擴(kuò)增曲線正常，熔解曲線分析顯示呈銳而突出的單一產(chǎn)物峰。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

CT 值用經(jīng)典的 2-△△CT法[13]處理后，用 SPSS17.0 統(tǒng)計軟件處理，單因素方差分析和皮爾遜相關(guān)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計學(xué)顯著性水平定為0.05。

表2 熒光定量PCR引物

2 結(jié)果

2.1 腓腸肌炎性因子基因表達(dá)

表3 腓腸肌炎癥相關(guān)基因表達(dá)相對C組變化倍數(shù)

表3顯示，C組、E1組和E2組三組間比較，促炎因子TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)量無顯著差異（P>0.05）；E1 組抑炎因子白介素 10（IL-10）mRNA表達(dá)量相對C組顯著降低 （P<0.05），E2組相對C組極顯著降低 （P<0.01），E1組和E2組間無差異；E1組和E2組趨化因子RANTES mRNA表達(dá)量相對C組顯著增加 （P<0.05），E1組和E2組間無差異。IL-10與RANTES呈直線負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.56（P<0.05）。

2.2 腓腸肌氧化應(yīng)激基因表達(dá)

表4 腓腸肌氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)相對C組變化倍數(shù)

表4顯示，E1組和E2組NADPH氧化酶催化亞基gp91phox mRNA表達(dá)量相對C組有增加趨勢，但三組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與C組相比，E1組蛋白激酶C-δ（PKC-δ）mRNA表達(dá)量顯著增加（P<0.05），E2組 PKC-δ mRNA 表達(dá)量相對E1組降低，仍高于C組水平，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

因炎癥水平是影響骨骼肌功能狀態(tài)的重要因素，因此，本文對過度訓(xùn)練時骨骼肌中炎性因子基因表達(dá)水平進(jìn)行了考察。結(jié)果表明:過度訓(xùn)練對大鼠腓腸肌促炎因子TNF-α和IL-1β表達(dá)無顯著影響，與安靜對照組相比，過度訓(xùn)練后36 h組或恢復(fù)7天組TNF-α和IL-1β表達(dá)均無顯著變化；但過度訓(xùn)練顯著抑制抑炎因子IL-10表達(dá)，與安靜對照組相比，運(yùn)動后36 h組IL-10表達(dá)量顯著降低，恢復(fù)7天后并未恢復(fù)正常，而呈進(jìn)一步下降趨勢（P<0.01）。此外，過度訓(xùn)練顯著上調(diào)趨化因子RANTES表達(dá)，運(yùn)動后36 h組和恢復(fù)7天組RANTES表達(dá)均顯著高于安靜對照組，約為安靜對照組的2倍。且IL-10與RANTES呈直線負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.56（P<0.05）。上述結(jié)果表明，過度訓(xùn)練使抑炎因子IL-10表達(dá)降低，使趨化因子RANTES表達(dá)顯著增加。即過度訓(xùn)練使腓腸肌促炎因子和抑炎因子比例失衡，趨化因子表達(dá)增強(qiáng)，從而加劇腓腸肌炎癥反應(yīng)，且停訓(xùn)1周后這種炎癥狀態(tài)并無明顯改善。本研究結(jié)果與Hamada[14]的研究結(jié)果有所不同，他采用75%VO2max強(qiáng)度下坡跑，運(yùn)動45分鐘，停止運(yùn)動72 h后進(jìn)行肌肉活檢，發(fā)現(xiàn)年輕組和老年組肌肉TNF-α表達(dá)量均顯著增加，而僅老年組肌肉IL-1β表達(dá)量顯著增加，年輕組無顯著變化。推測骨骼肌中炎性因子表達(dá)受運(yùn)動強(qiáng)度、運(yùn)動形式、運(yùn)動時間、年齡等多種因素的影響。

除考察炎性因子表達(dá)外，本實驗還測定了骨骼肌氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)。NADPH氧化酶可介導(dǎo)ROS生成，從而在組織氧化應(yīng)激中發(fā)揮作用。NADPH氧化酶由6個亞單位組成:胞膜亞單位（gp91phox、p22phox）和胞質(zhì)亞單位（p47phox、p40phox、p67phox及Rac蛋白）。靜息時上述成分處于解離狀態(tài)，沒有催化活性，受刺激后，p47phox發(fā)生磷酸化激活，募集其他胞質(zhì)成分一起轉(zhuǎn)位到胞膜，與胞膜亞單位結(jié)合組裝成有活性的NADPH氧化酶，從而發(fā)揮催化活性[15，16]。 最新研究表明，p47phox 的磷酸化受PKC-δ調(diào)控，PKC-δ是多種組織或細(xì)胞中NADPH 氧化酶活性的上游調(diào)控分子[7，17-19]。 本研究發(fā)現(xiàn)，雖然過度訓(xùn)練對腓腸肌gp91phox表達(dá)無顯著影響，但調(diào)控其活性的信號分子PKC-δ在運(yùn)動后36 h表達(dá)量顯著增加，它可使p47phox磷酸化激活，促使各亞基與gp91phox等組裝成有活性的NADPH氧化酶，從而介導(dǎo)超氧陰離子及過氧化物的生成，加劇組織氧化應(yīng)激水平。

4 總結(jié)

過度訓(xùn)練對大鼠骨骼肌TNF-α和IL-1β表達(dá)無顯著影響，但可顯著上調(diào)RANTES基因表達(dá)和下調(diào)IL-10基因表達(dá)；過度訓(xùn)練可上調(diào)骨骼肌氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)。

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