基于共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法的芡實紅外指紋圖譜研究Δ

陳蓉，陳廣云，沈蓓，樂巍，吳啟南（南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京210046）

基于共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法的芡實紅外指紋圖譜研究Δ

陳蓉＊，陳廣云，沈蓓，樂巍，吳啟南#（南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京210046）

目的：建立不同產(chǎn)地芡實的紅外指紋圖譜。方法：利用共有峰率和變異峰率2個指標，以不同產(chǎn)地芡實的紅外指紋圖譜為標準，計算出17個樣品間的共有峰率和變異峰率，按照其大小建立了不同的共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法，研究各產(chǎn)地芡實的異同。結(jié)果：產(chǎn)地相近的S13與S12、S14之間，S2與S3之間有很高的共有峰率（均不低于82.4%）和很低的變異峰率（均不超過21.4%）；產(chǎn)地不同但品種一致的S9與S1、S15之間，S4與S6之間有不高的共有峰率（均不超過52.4%）和不低的變異峰率（均不低于33.3%）；地理位置相距較遠的S16與S8、S6之間，S17與S4、S8之間有較低的共有峰率（均不超過47.6%）和較高的變異峰率（均不低于50.0%）；產(chǎn)地不同且采收期較近，造成了S10與其他產(chǎn)地樣品相比有著極低的共有峰率（均不超過35.7%）和極高的變異峰率（幾乎均高于100%）。結(jié)論：雙指標序列分析法結(jié)合紅外指紋圖譜能夠指導判別不同產(chǎn)地的芡實，簡便、快捷，可為芡實等水生植物藥材的質(zhì)量評價提供一種新方法。

芡實；紅外指紋圖譜；共有峰率；變異峰率；雙指標序列分析法；產(chǎn)地

紅外光譜（Infrared spectra，IR）是任何化合物都可吸收的譜線[1]，可用來推斷中藥中主要化學成分的結(jié)構(gòu)，對活性成分進行定量分析，鑒別藥材產(chǎn)地、真?zhèn)?、摻假等情況?，F(xiàn)代化學計量學已經(jīng)成功應(yīng)用于紅外數(shù)據(jù)和圖譜的分析，陳植成等[2]利用求導法（包括一階、二階求導）、數(shù)字濾波、數(shù)據(jù)平滑、矢量歸一化、傅里葉變換和卷積運算，以及小波變換等方法處理紅外分析信號，可以提高圖譜的信噪比、改良分析信號的質(zhì)量和還原被扭曲的圖譜[3]。利用主成分分析法、因子分析法、偏最小二乘法等校正方法處理紅外光譜數(shù)據(jù)，可以迅速而準確地鑒別和分類中藥[4，5]。采用獨立軟模式類簇法、聚類分析法和陣列相關(guān)系數(shù)比對法等化學模式識別紅外數(shù)據(jù)，可以判斷中藥的產(chǎn)地、道地性、采收時間和配方中藥的質(zhì)量等[6～9]。利用二維相關(guān)法可以鑒別中藥材的真?zhèn)魏推贩N等[10]。近年來，出現(xiàn)了一種新的數(shù)據(jù)處理方法——多維共有峰率和變異峰率雙指標序列法[11]。此法可用于高效液相色譜[12]，也可用于紅外光譜的分析，避免了煩瑣的數(shù)學建模，只需簡單的公式計算即可評價差異。

目前，有關(guān)芡實的鑒別方法主要有經(jīng)驗鑒別、顯微鑒別、薄層鑒別。由于芡實市售品中摻假種類不多、涉及面不廣，因此單一的鑒別方法難以鑒別出真?zhèn)?，更難辨別出其品質(zhì)的優(yōu)劣。在理化鑒別法中一般采用的許多現(xiàn)代儀器分析方法如色譜和光譜等，均需對藥材進行預處理，既耗時間又耗試藥，且操作煩瑣。利用多維共有峰率和變異峰率雙指標序列法對不同產(chǎn)地芡實藥材紅外指紋圖譜進行分析，克服了多種中藥鑒別方法的局限性，可達到快速對芡實進行歸類鑒別的目的，為其質(zhì)量標準的提升提供了一種新的分析方法。

1 儀器與試藥

IR100傅里葉變換紅外光譜儀（美國Nicolet公司）；Encompass紅外采集系統(tǒng)（美國Thermo公司）；YS-2壓片機（上海山岳科學儀器公司）；WS70-1紅外線快速干燥器（上海索譜儀器有限公司）。

KBr（光譜純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20101126）；芡實對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121421-200501）。芡實樣品分別來源于全國16個產(chǎn)地（見表1），均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學藥學院吳啟南教授鑒定為睡蓮科植物芡Euryale ferox Salisb.的干燥成熟種仁。

表1 芡實樣品來源Tab 1 Sources of Euryale ferox

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

取17批芡實藥材（含對照藥材），粉碎，過200目篩，取其篩后粉末少量，與干燥KBr粉末按1∶100混合研磨均勻壓片（約10 mPa，制成透明薄片），直接放入傅里葉變換紅外光譜儀中測定。掃描范圍4 000～400 cm－1，分辨率4 cm－1，掃描累加次數(shù)16次，掃描時扣除H2O和CO2的干擾。

2.2 方法學考察[13]

2.2.1 精密度試驗 取S1樣品少許，按上述樣品處理方法壓片后連續(xù)測定6次，得紅外圖譜，計算各圖譜間的相關(guān)系數(shù)（r）及RSD。結(jié)果，r均＞0.997 8，RSD＜0.53%（n＝6），表明本方法精密度較好。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗 取S1樣品少許，按上述樣品處理方法壓片后，分別于2、4、6、8、10、12 h測定，得紅外圖譜，計算各圖譜間的r及RSD。結(jié)果，r均＞0.998 5，RSD＜0.84%（n＝6），表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3 重復性試驗 取S1樣品少許，共6份，分別按上述樣品處理方法壓片后測定，得紅外圖譜，計算各圖譜間的r及RSD。結(jié)果，r均＞0.993 7，RSD＜0.92%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.3 芡實紅外指紋圖譜及數(shù)據(jù)分析

將17批芡實藥材分別按上述方法進行測定，得紅外圖譜。芡實紅外共有模式見圖1；不同產(chǎn)地芡實的紅外指紋圖譜見圖2；芡實紅外指紋圖譜波數(shù)及共有峰見表2。

圖1 芡實紅外共有模式Fig 1 Common pattern of FTIR of Euryale ferox

圖2 不同產(chǎn)地芡實的紅外指紋圖譜Fig 2 IR fingerprint of Euryale ferox from different areas

2.3.1 共有峰的確定 對于一組吸收峰而言，若組內(nèi)吸收峰的最大波數(shù)差顯著小于其與相鄰組之間的平均波數(shù)差，就確定該組峰是一組共有峰[14]。在表2中，多組峰滿足此法，可以判定為共有峰。如3 436.69 cm－1處對應(yīng)的一組峰的平均波數(shù)為3 400.91 cm－1，組內(nèi)最大波數(shù)差為87.66 cm－1，鄰近的前后2組峰的平均波數(shù)差分別為168.62 cm－1和468.35 cm－1，2個值明顯大于87.66 cm－1，故可確認3 436.69 cm－1處對應(yīng)的一組峰是共有峰；同理，1 156.50 cm－1處對應(yīng)的一組峰的平均波數(shù)為1 155.82 cm－1，前后相鄰組峰的平均波數(shù)差分別為212.86 cm－1和74.41 cm－1，明顯大于組內(nèi)最大波數(shù)差1.65 cm－1，故可判斷該組峰也是共有峰。

2.3.2 紅外原譜分析 由圖1可知，在波數(shù)為3 400、2 931、1 654、1 540、1 368、1 155、1 081、1 021、858、575 cm－1等處，均有吸收。其中，在波數(shù)為1 654、1 540 cm－1附近有酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶的強吸收峰，提示芡實中可能存在多糖β-多晶形；1 155、1 081 cm－1波數(shù)附近為糖苷類化合物的C－O伸縮振動峰；1 250～950 cm－1波數(shù)之間的吸收峰顯示多糖為吡喃構(gòu)型；又由于938 cm－1波數(shù)附近有微弱吸收鋒，說明多糖分子以α-糖苷鍵為主，并含有一定量的β-糖苷鍵[15]。在3 400、2 931、1 654、1 155、1 081、1 021、858、575 cm－1波數(shù)處均有吸收峰，在這些指紋區(qū)的淀粉特征峰

進一步證實了芡實是富含淀粉的中藥材。隨著淀粉含量的增加，淀粉的特征峰向低波數(shù)移動。1 654、1 540 cm－1波數(shù)處的骨架振動峰附于相應(yīng)的3 400 cm－1波數(shù)處的強而寬的NH2反對稱伸縮振動峰，且均為瘦尖的強吸收峰，為氨基酸多肽類的特征吸收峰，表明含有大量的氨基酸、蛋白質(zhì)類物質(zhì)，而芡實在這一位置的特征峰均較強，提示氨基酸含量較高。

表2 芡實紅外指紋圖譜波數(shù)及共有峰Tab 2 Wave numbers and common peaks of IR fingerprint of Euryale ferox

由圖2可知，各產(chǎn)地樣品的紅外圖譜相似，均在3 400、2 931、1 654、1 155、1 081、1 021 cm－1波數(shù)處有吸收峰。僅S10（廣東潮州）與其他產(chǎn)地芡實差異較大，無2 931、1 368、858 cm－1波數(shù)處的特征峰，增加了3 631.47、3 621.13、3 589.55、3 569.53 cm－1幾個高波數(shù)段的吸收峰，可能還有更多的O－H或者N－H取代。

2.4 芡實紅外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標序列[16]

2.4.1 共性鑒別指標 （1）共有峰率P＝（共有峰數(shù)Ng/2個紅外指紋圖譜中的獨立峰數(shù)Nd）×100%。（2）共有峰數(shù)Ng：指在比較的2個紅外指紋圖譜中均出現(xiàn)的吸收峰的個數(shù)。（3）獨立峰：紅外指紋圖譜中不同的吸收峰。其中，na為指紋圖譜a中相對于其共有峰的非共有峰數(shù)，稱為a的變異峰數(shù)；nb為指紋圖譜b中相對于其共有峰的非共有峰數(shù)，稱為b的變異峰數(shù)。（4）獨立峰數(shù)Nd：相互比較的2個紅外指紋圖譜中的獨立峰總數(shù)。Nd＝Ng+na+nb。

2.4.2 變異鑒別指標 變異峰率Pv：為一個紅外指紋圖譜中相對于共有峰的變異峰數(shù)與其共有峰數(shù)的比值。其中，Pva是指紋圖譜a的變異峰率，Pva＝（na/Ng）×100%；Pvb是指紋圖譜b的變異峰率，Pvb＝（nb/Ng）×100%。

共有峰率和變異峰率2個指標分別從共性和差異兩個方面全面衡量紅外指紋圖譜。共有峰率越高，表明2個圖譜的共性越大。在變異峰率指標中，以每個指紋圖譜中的變異峰數(shù)與共有峰數(shù)的比值可以很好地衡量指紋圖譜的漂移情況。2個指紋圖譜的變異峰率差異越大，說明2種樣品的差異越大；2個指紋圖譜的變異峰率都小，說明2種樣品種類或某種性質(zhì)相近。

2.4.3 雙指標序列 根據(jù)紅外指紋圖譜共有峰率和變異峰率公式，分別以各樣品為標準，計算其他樣品相對該樣品的共有峰率和變異峰率，按照共有峰率值排序，該序列即為共有峰率和變異峰率雙指標序列。n個樣品可得n個不同序列，故可構(gòu)成n維序列空間。通過該序列空間可以精確知道任意一個樣品與其他樣品的親疏遠近關(guān)系。在本試驗中，17個樣品各自為參照點建立的17個共有峰率和變異峰率雙指標序列，形成17維序列空間，加上共有峰率和變異峰率雙指標空間，可以在2+17維（即19維）空間中考察各個樣品的異同，使該法具有較強的鑒別能力。33.3，33.3），S17（56.0；42.9，35.7），S12（54.6；66.7，16.7），S9S13（54.2；53.9，30.8），S14（53.9；42.9，42.9），S4（52.4；81.8，9.1），S15（52.2；66.7，25.0），S7（50.0；81.8，18.2），S11（48.0；66.7，41.7），S8（40.0；150.0，0.0），S6（40.0；100.0，50.0），S10（29.2；185.7，57.1）；

續(xù)表2Continued tab 2

S17 ∶S5（77.3；11.8，17.7），S11（71.4；26.7，13.3），S6（70.0；35.7，7.1），S14（70.0；18.8，25.0），S7（68.4；46.2，0.0），S2S3S12（65.0；46.2，7.7），S13（63.6；35.7，21.4），S15（61.9；46.2，15.4），S16（56.0；35.7，42.9），S1（52.2；66.7，25.0），S9（50.0；58.3，41.7），S4（47.6；90.0，20.0），S8（42.1；137.5，0.0），S10（25.0；216.7，8.3）。

S5∶S13（76.2；25.0，6.3）表示該序列以S5為標準計算其他樣品指紋圖譜的共有峰率和變異峰率。該序列片段表示S5和S13的共有峰率為76.2，其中S5的變異峰率為25.0，S13的變異峰率為6.3。

S2∶S12（64.7；27.3，27.3）表示該序列以S2為標準計算其他樣品指紋圖譜的共有峰率和變異峰率。該序列片段表示S2和S12的共有峰率為64.7，S2、S12具有相同的變異峰率，為27.3。

S1∶S2S3（70.6；25.0，16.7）表示S2、S3與S1的共有峰率相同，為70.6；S1的變異峰率為25.0，S2、S3的變異峰率為16.7。

S1∶S6S15（76.5；15.4，15.4）表示S6、S15與S1的共有峰率相同，為76.5；變異峰率也相同，為15.4。

不同序列中不同樣品的共有峰率不同，表明樣品之間存在不同的關(guān)系。雙指標序列法能在多維空間中尋找到某一樣品的相似品，克服了單一空間的局限性，指導更合理的鑒別結(jié)論。與某一樣品具有相同共有峰率的樣品，往往具有不同的變異峰率；當然，也存在相同變異峰率的樣品。雙指標序列法較單指標更為深層次地區(qū)分和認同樣品，如S7∶S6（64.7；18.2，30.4）、S16（50.0；18.2，81.8），表明S7與S6、S16具有相同的變異峰率，為18.2，但S7與S6、S16的共有峰率不同，分別是64.7與50.0，可以做出更好的區(qū)分。又如，S9∶S1S15（52.4；54.6，36.4）中，S1、S15相對S9具有相同的共有峰率及變異峰率，說明S1、S15相對于S9非常相似。

2.5 基本關(guān)系組、對及分析

A組：S13∶S12（82.4；21.4，0.0），S14（85.0；0.0，17.7）；S2∶S3（86.7；7.7，7.7）。B組：S9∶S1S15（52.4；54.6，36.4）；S4∶S6（50.0；33.3，66.7）。C 組：S16∶S8（40.0；150.0，0.0）；S17∶S4（47.6；90.0，20.0），S8（42.1；137.5，0.0）。

D 組：S10∶S8（35.7；120.0，60.0），S9（33.3；57.1，142.9），S5S16（29.2；57.1，185.7），S2S3S12（25.0；120.0，180.0），S17（25.0；8.3，216.7），S1S6S15（23.8；120.0，200.0），S11S13（21.7；120.0，240.0），S4（21.1；175.0，200.0），S7（20.0；175.0，225.0），S14（19.2；120.0，300.0）。

在A組中，S13與S12、S14之間，S2與S3之間有很高的共有峰率和很低的變異峰率。S13、S12、S14的產(chǎn)地均為江蘇省，分別為寶應(yīng)、蘇州、金湖，為蘇芡的主要產(chǎn)區(qū)，其中S13寶應(yīng)、S14金湖的地理位置相鄰，批號反映的采收時間也非常接近，氣候和生長環(huán)境相似。S2與S3的產(chǎn)地分別為山東菏澤、安徽蕪湖，兩省的地理位置接近，氣候、生長環(huán)境近似，且均為刺芡的傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)，是臨床用芡實的主要來源，其質(zhì)量相似性很高。

在B組中，S9與S1、S15，S4與S6之間的共有峰率與變異峰率相近，即共有峰率都不高，變異峰率都不低。S9的產(chǎn)地為廣東肇慶，S1為四川成都，S15為江蘇建湖，這幾個產(chǎn)地上沒有關(guān)聯(lián)，氣候、生長環(huán)境有差異，但品種一致，均為刺芡，具有一定的親緣性。同理，S4的產(chǎn)地為河北安國，S6為對照藥材，雖產(chǎn)地未知，但明確的品種也都為刺芡，故在一定程度上有相似性，也具有明顯的產(chǎn)地差異。

在C組中，S16與S8之間，S17與S4、S8之間有很低的共有峰率和很高的變異峰率。S16與S8的產(chǎn)地分別為江蘇浦口、湖北蘄春，S17與S4、S8的產(chǎn)地分別為四川中江、河北安國、湖北蘄春，地理位置相距較遠，氣候和生長環(huán)境相差很大。且江蘇浦口和湖北蘄春為野生品種、自行采集，其他幾個產(chǎn)地均為規(guī)模生產(chǎn)，品種較為純正。所得數(shù)據(jù)也反映了上述一些實際情況。

在D組中，S10與其他產(chǎn)地樣品之間的共有峰率都極低，變異峰率都極高。S10的批號反映的采收時間為2010年，存放時間最短，與其他批次藥材采收時間相距較遠，所以差異較大。S10的產(chǎn)地為廣東潮州，與S1四川成都、S6對照藥材、S15江蘇建湖、S11福建莆田、S13江蘇寶應(yīng)、S4河北安國、S7湖南益陽、S14江蘇金湖、S17四川中江、S2山東菏澤、S3安徽蕪湖、S5江西武穴、S16江蘇浦口的地理位置相距較遠，氣候、生長環(huán)境差異很大，且廣東為芡實的主要產(chǎn)區(qū)，具有很大的規(guī)模，因此造成S10與其他產(chǎn)地樣品的共有峰率極低，變異峰率極高。

由上述分析可知，產(chǎn)地相同或比較接近的藥材之間共有峰率較高，相似度較高；而產(chǎn)地、氣候、生長環(huán)境相差較大或采收存放時間相差較大的藥材之間變異峰率較高，差異較大；品種在一定程度上也決定了產(chǎn)地差異。這些分析確切地反映了實際情況。

3 討論

芡實這類功效緩和的中藥，在物質(zhì)基礎(chǔ)研究上較為薄弱，質(zhì)量評價手段局限。紅外光譜具有特征性強、少量、準確、簡便、迅速的特點，并能夠判斷官能團信息，在藥材定性鑒別研究中有其獨特優(yōu)勢，可以作為芡實等淀粉含量較高的中藥材的研究參考方法。本試驗對17個產(chǎn)地芡實藥材粉末進行了紅外光譜測定，結(jié)果表明：不同產(chǎn)地芡實粉末的紅外光譜有較為顯著的差異，原譜在特征區(qū)（4 000～1 250 cm－1）和指紋區(qū)（1 250～400 cm－1）的鑒別性較好，通過峰位能夠辨認出多糖、淀粉、氨基酸等主要成分的官能團。進一步可以結(jié)合二階導數(shù)圖譜在指紋區(qū)的差異判別，來反映產(chǎn)地差別及與淀粉的相似程度，初步判定淀粉含量多少。可見，紅外光譜可以作為其種間鑒別的輔助手段。但本試驗中采用的樣本量還不是很大，需要進一步增大檢測數(shù)量來提高測試的準確性。

雙指標序列分析法比較了17個產(chǎn)地芡實藥材的相似度，依據(jù)共有峰率和變異峰率大小分為了A、B、C、D 4類。產(chǎn)地相近樣品之間有很高的共有峰率（均不低于82.4%）和很低的變異峰率（均不超過21.4%）；產(chǎn)地不同但品種一致的樣品之間有不高的共有峰率（均不超過52.4%）和不低的變異峰率（均不低于33.3%）；地理位置相距較遠的樣品之間有較低的共有峰率（均不超過47.6%）和較高的變異峰率（均不低于50.0%）；產(chǎn)地不同且采收期較近，造成了S10與其他產(chǎn)地樣品相比有著極低的共有峰率（均不超過35.7%）和極高的變異峰率（幾乎均高于100%）。此外，本試驗發(fā)現(xiàn)與中檢所對照藥材S6相似度最高的樣品是S1，但相似度也僅有76.5%，其他產(chǎn)地樣品與之相似度更低。因此，對照藥材產(chǎn)地和種的確定是否可靠有待進一步探討。

水生植物藥材的品質(zhì)受多種因素影響，其差異在一定程度上取決于環(huán)境變化[17]。雙指標序列分析法結(jié)合紅外指紋圖譜，能夠指導芡實藥材質(zhì)量標準的提升，也為芡實等水生植物藥材的品質(zhì)評價提供了參考方法。

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Study on IR Fingerprint of Euryale ferox Based on Dual-index Sequence Analysis of Common and Variant Peak Ratios

CHEN Rong，CHEN Guang-yun，SHEN Bei，YUE Wei，WU Qi-nan
（College of Pharmacy，Nanjing University of TCM，Nanjing 210046，China）

OBJECTIVE：To establish IR fingerprint of Euryale ferox collected from different regions.METHODS：Using common peak ratio index and variant peak ratio index，based on IR fingerprint of Euryale ferox from different regions，common peak ratio and variant peak ratio of 17 samples were calculated respectively to set up a new method called dual-index sequence analysis for distinguishing samples from different regions.RESULTS：It showed sample S13 and S12，S14，sample S2 and S3 were the most similar samples with higher common peak ratio（≥82.4%）and lower variant peak ratio（≤21.4%）.Sample S9 and S1，S15，sample S4 and S6 from different regions but of same specie，were average with similar common peak ratio（≤52.4%）and variant peak ratio（≥33.3%）.However，sample S16 and S8，S6，sample S17 and S4，S8 from the farther regions，were of significant disparity with lower common peak ratio（≤47.6%）and higher variant peak ratio（≥50.0%）.In addition，sample S10 and other samples from different region but at closer collecting time，which resulted in much lower common peak ratio（≤35.7%）and much higher variant peak ratio（≥100.0%）.CONCLUSION：The combination of dual-index sequence analysis and IR fingerprint gave a simple and efficient guidance in distinguishing Euryale ferox collected from different regions，which offer a new approach to quality evaluation of Euryale ferox and other aquatic plants.

Euryale ferox；IR fingerprint；Common peak ratios；Variant peak ratios；Dual-index sequence analysis；Region

O657.3；R284.1

A

1001-0408（2012）23-2141-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.23.12

Δ國家科技支撐計劃項目（2011BAI04B06）；《中國藥典》2010版一部標準研究課題（YD-115）。

＊碩士研究生。研究方向：中藥品質(zhì)評價。E-mail：garfield 860911@hotmail.com

#通訊作者：教授，博士研究生導師。研究方向：中藥品質(zhì)評價。電話：025-85811059。E-mail：qnlxw@yahoo.com.cn

2011-07-04

2011-09-06）