胰島素對人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-543生長的增殖作用

趙肖霞，付全航，鄭愛文

(1.浙江省東陽市人民醫(yī)院，浙江 東陽 322100;2.浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 315300)

近年胰島素及其類似物與癌癥的關(guān)聯(lián)性備受關(guān)注，德國、瑞典、英國和蘇格蘭的臨床回顧性研究提示某些胰島素類似物的促有絲分裂效應(yīng)增加可能具有潛在的致癌作用［1-2］。而這種效應(yīng)主要由胰島素樣生長因子(IGF-1)受體介導(dǎo)，胰島素及其類似物可激活胰島素受體和IGF-1［3］，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究探討胰島素在不同濃度和作用時間對體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-543生長的增殖作用，為臨床使用提供依據(jù)。

1 材料

RPMI 1640培養(yǎng)液、10%胎牛血清(美國Hyclone公司);普通胰島素(丹麥Novo Nordisk公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國Sigma公司)，二甲亞砜(DMSO，美國Amresco公司)。

EPICSXL型流式細(xì)胞儀(美國Coulter公司);MK3型酶標(biāo)儀(美國Thermo-Lab systems公司)。

人乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-543)由浙江省腫瘤醫(yī)院病理科提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MDA-MB-543接種在含10%熱滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液內(nèi)，置37℃、5%CO2、飽和濕度孵育箱常規(guī)培養(yǎng)，用D-Hanks配制的0.3%胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖

將對數(shù)生長期的細(xì)胞用0.3%胰腺蛋白酶消化并制成1×105個/mL的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。更換無血清的培養(yǎng)液，加入胰島素使終濃度為1，5，10，20，40 mU/mL，平行設(shè)置空白對照組，每組設(shè)6個孔，繼續(xù)培養(yǎng)2，4，8，16，24，32 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，振蕩后繼續(xù)37℃、5%CO2孵育4 h，吸去上清液，每孔加入DMSO 200μL，振蕩5 min，用酶標(biāo)儀測定在490 nm波長處的吸光度(A)值。A值代表細(xì)胞增殖能力。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

MDA-MB-543細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，每皿3mL(含細(xì)胞5×105～1×106個)，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)24 h，更換至無血清的培養(yǎng)基，加入胰島素使終濃度為1，5，10，20，40 mU/mL，繼續(xù)培養(yǎng)16 h后收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，離心5 min，棄上清后，細(xì)胞沉淀約0.5mL用70%乙醇2mL混勻重懸，4℃放置8 h以上，碘化丙啶(PI)染色，以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布。以同樣方法檢測10mU/mL 濃度組在胰島素作用2，4，8，16，24，32 h時的細(xì)胞周期分布。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計量資料以(±s)形式表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 胰島素對MDA-MB-543增殖的影響

在胰島素作用時間相同條件下，各時間點胰島素濃度在1～10mU/mL范圍內(nèi)，均隨胰島素濃度升高對MDA-MB-543增殖作用逐步增強(qiáng)，而之后逐漸減弱;而且，各時間點在10mU/mL時的A值與對照組比較均有顯著性差異(P＜0.05或0.01)。在胰島素濃度相同條件下，各濃度在2～16 h范圍內(nèi)，均隨胰島素作用時間延長對MDA-MB-543增殖作用逐步增強(qiáng)，而之后逐漸減弱;而且，各濃度在作用8～16 h時的A值與對照組比較均有顯著性差異(P＜0.05或0.01)。這提示胰島素能明顯促進(jìn)MDAMB-543的增殖，且具有明顯的劑量和時間依賴關(guān)系，在10mU/mL作用16 h時最強(qiáng)。結(jié)果見表1。

表1 胰島素對MDA-MB-543增殖的影響(n=6，±s)Tab.1 Effect of Insulin on the proliferation of MDA-MB-543(n=6，±s)

表1 胰島素對MDA-MB-543增殖的影響(n=6，±s)Tab.1 Effect of Insulin on the proliferation of MDA-MB-543(n=6，±s)

與0 h比較:1 P＜0.05，2 P＜0.01;與對照組比較:3 P＜0.05，4 P＜0.01Compared with 0 h:1 P＜0.05，2 P＜0.01;Compared with control group:3 P＜0.05，4 P＜0.01

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3.2 胰島素對MDA-MB-543細(xì)胞周期的影響

在1～10mU/mL范圍內(nèi)，隨胰島素濃度增加，反映增殖活性的S期和G2/M期細(xì)胞比例均逐漸增多，而之后逐漸減少;而且，其中S期細(xì)胞比例在1～20 mU/mL范圍內(nèi)與對照組比較有顯著性差異(均P＜0.05或0.01)。在2～16 h范圍內(nèi)，隨胰島素時間延長，反映增殖活性的S期和G2/M期細(xì)胞比例均逐漸增多，而之后逐漸減少;而且，其中S期細(xì)胞比例在2～24 h范圍內(nèi)與對照組比較有顯著性差異(均P＜0.05或0.01)。上述表明，胰島素的增殖作用主要作用于細(xì)胞周期S期，在1～10mU/mL、2～16 h范圍內(nèi)具有明顯的劑量和時間依賴關(guān)系，與MTT結(jié)果相符合。結(jié)果見表2～3。

4 討論

胰島素是一種蛋白質(zhì)激素，除重要的機(jī)體代謝調(diào)節(jié)作用外，促生長作用也被大量體外實驗證實［4-6］。1967年Heuson等報道胰島素可加快小鼠乳腺癌細(xì)胞的生長、增殖［7］。近年大量的流行病學(xué)調(diào)查資料發(fā)現(xiàn)［8］，高胰島素水平的人群更易發(fā)生乳腺癌，乳腺癌婦女的血胰島素、IGF-1水平明顯高于正常人群，并與乳腺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及生存率有密切相關(guān)。因此，胰島素促生長作用與腫瘤發(fā)生危險性之間的關(guān)系成為人們關(guān)注的熱點。本實驗以在體外無血清培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-543為靶細(xì)胞，排除外源因素干擾，采用MTT法評估胰島素對人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-543的增殖狀況，并結(jié)合細(xì)胞周期分布檢測，以提高結(jié)果準(zhǔn)確性。

本實驗MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰島素能明顯促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-543的增殖，這種增殖作用在10mU/mL、作用16 h時作用最明顯，之后逐漸減弱，具有明顯的劑量和時間依賴關(guān)系。關(guān)于胰島素促進(jìn)增殖的機(jī)制，許多學(xué)者已進(jìn)行了深入研究。目前已經(jīng)確認(rèn)胰島素的生物效應(yīng)是通過一系列的蛋白激酶、磷酸酶的級聯(lián)反應(yīng)實現(xiàn)的，與細(xì)胞增殖有關(guān)的胰島素信號通路主要為Ras和磷脂酰肌醇3激酶途徑，而這兩條通路都必須由胰島素和胰島素緊密受體結(jié)合后才能激活酪氨酸激酶活性而發(fā)揮生物效應(yīng)［9］。研究證實［10］，多種腫瘤細(xì)胞(人肝細(xì)胞癌、乳腺癌和多發(fā)性骨髓瘤等)上胰島素受體存在異常過度表達(dá)及其親和力明顯增高。筆者認(rèn)為正因為如此，胰島素在一定濃度范圍內(nèi)可與細(xì)胞膜上受體達(dá)到最大限度結(jié)合，從而發(fā)揮最大的促進(jìn)細(xì)胞分裂等生物學(xué)效應(yīng)，而超出此濃度范圍時，胰島素并不能直接發(fā)揮作用。同時，隨胰島素作用時間延長，胰島素與其受體的復(fù)合物被內(nèi)吞入細(xì)胞，被特異性的降解酶所降解，從而停止其生物效應(yīng)［11］。

細(xì)胞周期分布檢測結(jié)果進(jìn)一步證實了上述幾點，并顯示胰島素主要作用于細(xì)胞周期S期。Mawson等［12］研究表明，胰島素可使CyclinD的表達(dá)異常增高，使細(xì)胞迅速通過G0/G1期限制點進(jìn)入S期，細(xì)胞周期加快，使細(xì)胞以更快的速度異常增殖。而有研究表明CyclinD的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［13］，上述這些因素都可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。但本實驗MTT和細(xì)胞周期結(jié)果顯示，這種增殖作用具有的劑量和時間的依賴關(guān)系是在一定濃度和時間內(nèi)產(chǎn)生的，并且是短暫和可逆的。因此，我們認(rèn)為胰島素雖然能誘導(dǎo)MDA-MB-543細(xì)胞加快進(jìn)入細(xì)胞周期S期增殖，并呈明顯的劑量和時間依賴關(guān)系，但這種作用是短暫和可逆的，臨床應(yīng)用是安全的。這與田春桃等［14］的結(jié)論一致。但是否存在其他激活機(jī)制，胰島素類似物是否具有相同的增殖作用及在靶向治療中的應(yīng)用等問題值得進(jìn)一步探討。

表2 胰島素(作用16 h)濃度對MDA-MB-543細(xì)胞周期的影響(n=6，±s)Tab.2 Effect of Insulin(action time 16 h)concentration on the MDA-MB-543 cell cycle(n=6，±s)

表2 胰島素(作用16 h)濃度對MDA-MB-543細(xì)胞周期的影響(n=6，±s)Tab.2 Effect of Insulin(action time 16 h)concentration on the MDA-MB-543 cell cycle(n=6，±s)

與對照組比較:1 P＜0.05，2 P＜0.01Compared with control group:1 P＜0.05，2P＜0.01

組 別 濃度/(mU/mL)細(xì)胞周期分布/%G0/G1 S G2/M對照組 － 56.4±1.2 30.8±1.0 12.8±1.2胰島素組 1 51.4±1.31 35.6±1.41 13.0±1.3 5 47.5±1.52 48.7±1.72 13.8±1.5 10 22.9±2.22 62.5±2.32 14.6±1.9 20 35.8±1.82 50.2±2.02 14.0±1.6 40 51.5±1.6 34.8±1.7 13.7±1.4

表3 胰島素(10mU/mL)作用時間對MDA-MB-543細(xì)胞周期的影響(n=6，±s)Tab.3 Effect of Insulin(10mU/mL)time on the MDA-MB-543 cell cycle(n=6，±s)

表3 胰島素(10mU/mL)作用時間對MDA-MB-543細(xì)胞周期的影響(n=6，±s)Tab.3 Effect of Insulin(10mU/mL)time on the MDA-MB-543 cell cycle(n=6，±s)

與對照組比較:1 P＜0.05，2 P＜0.01Compared with control group:1 P＜0.05，2P＜0.01

組 別 作用時間/h細(xì)胞周期分布/%G0/G1 S G2/M對照組 － 56.3±1.2 30.6±1.2 12.7±1.1胰島素組 2 52.4±1.31 34.6±1.41 13.0±1.3 4 47.2±1.51 39.6±1.61 13.2±1.5 8 39.5±1.72 46.5±1.82 14.0±1.7 16 23.9±2.22 61.3±2.52 14.8±1.9 24 52.6±1.61 43.8±1.71 13.6±1.4 32 55.5±1.1 31.5±1.1 13.0±1.2

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