彩虹明櫻蛤多糖對小鼠急性化學性肝損傷的保護作用

向 維，陳松華，李朝品

(1.中國人民解放軍 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 療養(yǎng)區(qū)(全軍醫(yī)學康復中心)，江蘇 南京 211131;2.皖南醫(yī)學院 病原生物學教研室，安徽 蕪湖 241002)

我們前面的研究已經證實彩虹明櫻蛤多糖(Moerella iridescens polysaccharide，MIP)對小鼠的免疫功能具有一定的調節(jié)作用［1］，是一種良好的免疫調節(jié)劑。本研究采用小鼠CCl4肝損傷模型，觀察了MIP對急性肝損傷的保護作用。

1 材料

MIP的制備同文獻［1］。

聯(lián)苯雙酯滴丸(biphenyl dimethy dicarboxylate，BDD)，浙江萬邦藥業(yè)有限公司;氯仿、正丁醇、四氯化碳、橄欖油，國藥集團化學試劑有限公司;谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

BALB/c雌性昆明種小鼠，13～15周齡，體重18～22 g，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，許可證號:SCXK(蘇)2007-0001。

721分光光度計，北京瑞利分析儀器公司;CF16RX高速低溫離心機，日立公司。

2 方法

昆明種小鼠60只隨機等分成6組:正常對照組、CCl4模型組、聯(lián)苯雙酯滴丸組(200mg/kg)、MIP低、中、高劑量組(40，80，160mg/kg)。實驗室飼養(yǎng)3 d后，正常對照組及CCl4模型組ip生理鹽水;聯(lián)苯雙酯滴丸組和MIP低、中、高劑量組分別ip相應劑量藥物的生理鹽水溶液。給藥體積均為0.1mL/10g，1次/d，連續(xù)給藥7d。于末次給藥2h后，正常對照組ip橄欖油溶液0.1mL/10g，其余5組均ip等量0.1%CCl4橄欖油溶液。禁食不禁水，24 h后稱體重，摘眼球取血。血液3 000r/min離心10min，取血清超低溫冰箱凍存待測。采血后快速斷頭處死小鼠，剖取肝臟，取肝右葉組織0.5 g在冰生理鹽水中漂洗，濾紙拭干，用生理鹽水制成10%肝組織勻漿，離心取上清待測。同時取左葉相同部位肝臟，迅速投入10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片HE染色，光鏡下觀察肝組織切片的病理形態(tài)學變化［2］。

按試劑盒說明測定血清ALT和AST，組織勻漿MDA、SOD和GSH。計算肝臟指數(shù):(肝臟重量/體重)。

采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行動物隨機分組，各組實驗數(shù)據均以(±s)表示，樣本均數(shù)間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 肝臟指數(shù)檢測

MIP中、高劑量組比模型組略有降低，但并無統(tǒng)計學差異，結果見表1。

3.2 血清生化指標檢測

小鼠腹腔注射0.1%CCl4橄欖油溶液后，小鼠血清ALT、AST水平明顯升高，MIP能顯著降低肝損傷小鼠血清ALT和AST水平(P＜0.01)，結果見表1。

3.3 肝組織勻漿生化指標檢測

與正常對照組比較，CCl4模型組小鼠肝組織中MDA含量明顯升高，SOD與GSH活性顯著下降，提示肝臟出現(xiàn)脂質過氧化。而MIP中、高劑量組可顯著抑制肝組織中MDA的升高(P＜0.01)，并使SOD和GSH活性明顯升高(P＜0.05)，提示MIP有較強的抗氧化及清除氧自由基的作用，結果見表2。

表1 MIP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)、血清ALT和AST活性的影響(n=10，±s)Tab.1 Effects of MIPon liver index，and the activities of ALT and AST in serum of acute hepatic injury mice induced by CCl4(n=10，±s)

表1 MIP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)、血清ALT和AST活性的影響(n=10，±s)Tab.1 Effects of MIPon liver index，and the activities of ALT and AST in serum of acute hepatic injury mice induced by CCl4(n=10，±s)

與模型組比較:1 P＜0.05，2P＜0.01Compared with model group:1P＜0.05，2 P＜0.01

MIP 中劑量組 80 463.38±23.46 52.89±12.1489.26±28.89 MIP 高劑量組 160 452.23±27.66 41.28±14.362 74.12±27.972

表2 MIP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD和GSH的影響(n=10，±s)Tab.2 Effects of MIPon MDA and SOD and GSH in hepatic homogenate of acute hepatic injury mice induced by CCl4(n=10，±s)

表2 MIP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD和GSH的影響(n=10，±s)Tab.2 Effects of MIPon MDA and SOD and GSH in hepatic homogenate of acute hepatic injury mice induced by CCl4(n=10，±s)

與模型組比較:1 P＜0.05，2 P＜0.01Compared with model group:1 P＜0.05，2 P＜0.01

MIP 低劑量組 40 3.92±1.481 48.23±1.661 28.36±2.281 MIP 中劑量組 80 3.65±0.562 52.77±1.582 31.37±0.761 MIP 高劑量組 160 3.33±0.372 54.49±1.162 33.85±1.332

3.4 肝臟組織病理學觀察

正常對照組小鼠肝臟外觀呈紅褐色，質地濕潤、柔軟有光澤且富于彈性;光學顯徽鏡下可見肝小葉結構完整，輪廓清晰;肝細胞排列整齊，大小均勻，分界清楚，無炎細胞浸潤;肝細胞胞質豐富，含嗜堿性物質較多，核大而圓，見圖1A。CCl4模型組小鼠肝臟體積增大，質脆邊緣鈍而厚，表面呈黃褐色;鏡下見肝小葉結構破壞，肝細胞核消失，出現(xiàn)以中央靜脈為中心的局灶性肝細胞變性、壞死和大量炎細胞浸潤，見圖1B。聯(lián)苯雙酯滴丸組小鼠肝臟顏色較紅潤，有部分肝細胞有胞漿疏松，氣球樣變現(xiàn)象，見圖1C。MIP低劑量組肝臟雖未完全表現(xiàn)為正常對照組的紅褐色，但較模型組有明顯改觀;切片可見病變以中央靜脈周圍肝細胞的氣球樣變?yōu)橹?，肝細胞腫大，胞漿疏松，中央靜脈周圍有少量肝細胞壞死和炎癥細胞入侵，見圖1D。MIP中劑量組肝臟顏色較紅潤;切片可見有部分肝細胞有氣球樣變，但并無炎癥細胞入侵和明顯壞死，見圖1E。MIP高劑量組小鼠肝臟顏色紅潤，接近正常對照組，僅有少量肝細胞有胞漿疏松現(xiàn)象，見圖1F。

圖1 各組肝組織切片HE染色結果(×200)Fig.1 Light microscopy showing liver tissue in each group(HE staining，× 200)

4 討論

正常肝組織ALT主要分布于細胞漿內，AST則分布于線粒體中。在CCl4模型中，CCl4在肝微粒體細胞色素P450激活下生成三氯甲基自由基，這些自由基可與肝細胞內大分子發(fā)生共價結合，也可攻擊膜不飽和脂質，引起脂質過氧化，使肝細胞損傷，轉氨酶從受損的肝細胞內溢出，使血清中轉氨酶升高［3］。因此，ALT和AST的升高是肝炎活動的重要標志。SOD是動物機體內的抗氧化酶，其作用是清除自由基，防止自由基對細胞結構的損傷，體內SOD的活性，可以反映自由基的清除速度。MDA是不飽和脂肪酸氧化作用的終產物，它在血清中的含量可以間接反映自由基反應時組織的破壞程度。MDA的測定常與SOD的測定相互配合，SOD活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度［4］。因此，SOD及MDA可反映肝細胞損傷的程度和藥物對肝細胞的拮抗作用。GSH廣泛存在于人體的各種組織中，GSH水平降低意味著機體抗氧化能力下降，并引發(fā)機體的氧化應激反應，產生大量的自由基。在肝臟化學性損傷時，氧化應激消耗GSH引起肝臟GSH含量下降，機體抗氧化能力下降，并引發(fā)機體的氧化應激反應［5］。研究證實，多糖能夠提高SOD、GSH等抗氧化物酶的活性，降低脂質過氧化物的含量［6］。

本實驗結果顯示，MIP 3個劑量組能不同程度降低肝損傷小鼠血清ALT、AST及肝勻漿MDA水平，能不同程度增高肝損傷小鼠肝勻漿SOD和GSH的水平，且對小鼠肝臟的病理學損傷也有明顯改善。據此推斷，MIP對CCl4引起的小鼠急性肝損傷保護作用的機制可能是通過提高SOD等抗氧化物酶的活性，從而清除自由基，防止脂質過氧化，穩(wěn)定膜結構，起到保護肝臟的作用。對MIP抗氧化的作用機制有待進一步研究。

［1］向 維，陳松華，李朝品.彩虹明櫻蛤多糖對小鼠的免疫調節(jié)作用［J］.中國生化藥物雜志，2011，32(5):393-395.

［2］陳 奇.中藥藥理研究方法學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:943.

［3］Ozercan I H，Dagli A F，Ustundag B，etal.Does instant coffee prevent acute liver injury induced by carbon tetrachloride［J］.Hepatol Res，2006，35(3):163-165.

［4］Basn S.Carbon tetrachloride induced lipid peroxidation:eicosanoid formation and their regulation by antioxidant nutrien［J］.Toxicology，2003，189(2):113-127.

［5］Mehmetcik G，Ozdemirler G，Kocak T N，etal.Effect of pretreatment with artichoke extracton carbon tetrachloride-induced liver injury and oxidative stress［J］.Exp Toxicol Pathol，2008，60(1):475-480.

［6］周林珠，楊祥良，周井炎，等.多糖抗氧化作用研究進展［J］.中國生化藥物雜志，2002，23(4):210-212.