NOS2A基因啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與缺血性腦卒中關(guān)系的研究

闞春燕， 高 鵬， 袁 冬， 杜丹華， 吳 江

缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)是致殘率和致死率最高的常見(jiàn)疾病之一［1］。而動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)斑塊破裂和血栓形成是導(dǎo)致急性心腦血管事件的主要原因。

近年來(lái)，研究者認(rèn)識(shí)到動(dòng)脈粥樣硬化是由多種炎性細(xì)胞因子參與的血管慢性炎癥反應(yīng)過(guò)程，炎癥反應(yīng)和AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2］。由iNOS催化產(chǎn)生的NO是機(jī)體慢性炎癥反應(yīng)的重要參與因子之一［3］，可引起血管內(nèi)皮損傷、促進(jìn)血管壁的炎癥反應(yīng)，還可氧化LDL形成ox-LDL，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致粥樣斑塊的不穩(wěn)定［4］。因此，我們對(duì)編碼iNOS的NOS2A基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，探討其與缺血性腦卒中的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2009年～2010年的住院患者324例作為病例組，其中男234 例，女90 例，平均年齡(57.1 ±10.1)歲，經(jīng)神經(jīng)科檢查、頭部CT或頭部MRI明確腦卒中診斷，并除外房顫、腫瘤等栓子來(lái)源的腦栓塞性疾病，除外肝腎功能不全及血液系統(tǒng)疾病。由患者本人或其家屬提供患者的臨床癥狀及既往病史。對(duì)照組來(lái)自吉林大學(xué)第一醫(yī)院體檢中心的健康體檢者，共455例，其中男319例，女136例，平均年齡(50.7±8.8)歲。入組對(duì)象簽署知情同意書(shū)，并采集全血用于DNA提取。

1.2 選擇 NOS2A啟動(dòng)子區(qū)-969G/C，-1173C/T的兩個(gè)位點(diǎn)為遺傳標(biāo)記，通過(guò)對(duì)NOS2A啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序以分析這兩個(gè)位點(diǎn)的基因型。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 (1)標(biāo)本采集:抽取患者、對(duì)照者空腹外周靜脈血置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)基因組DNA的提取:采用Wizard基因組DNA提取試劑盒(美國(guó)Promega公司)抽提基因組DNA。(3)基因組DNA濃度與純度測(cè)定:用ND-1000紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)(NanoDrop，美國(guó))進(jìn)行定量測(cè)定，調(diào)整模板DNA濃度在25～50ng/μl。(4)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR):基因引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，其核苷酸序列如下:上游引物:5’-AAAACCCTCTCAAAACAGC-3’;下游引物:5’-TTGGTAGAGACTGGGTTTCA-3’。 反 應(yīng) 體 系(20μl):DNA 模板 2μl、10 × buffer 2μl、dNTP 1μl、PCR 引物2μl(上游引物、下游引物各 1μl、TaqDNA聚合酶 0.15μl、ddH2O 12.85μl)。PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性 95℃5min，變性 94℃30s，退火 66℃40s，延伸72℃1min30s，共進(jìn)行 38個(gè)循環(huán)，最后延伸 72℃10min。(5)PCR產(chǎn)物的檢測(cè):取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2μl進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，JS-380A凝膠成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)下觀察結(jié)果。(6)PCR產(chǎn)物回收純化:PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到AcroPrep 384濾板上進(jìn)行濃縮純化。(7)PCR產(chǎn)物測(cè)序:將已純化的基因組DNA樣本經(jīng)熱循環(huán)處理后于ABI 3730 DNA Analyzer(ABI，美國(guó))進(jìn)行掃描測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用擬和優(yōu)度檢驗(yàn)分析病例組和對(duì)照組基因型頻率的分布是否符合Hardy-Weinberg(H.W)平衡;UNPHASED遺傳學(xué)軟件應(yīng)用cocaphase對(duì)等位基因頻率進(jìn)行分析，SPSS 15.0軟件應(yīng)用卡方檢驗(yàn)對(duì)基因型頻率進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 -969G/C、-1173C/T不是中國(guó)北方漢族人的SNP位點(diǎn) 通過(guò)對(duì)NOS2A基因啟動(dòng)子區(qū)的測(cè)序，發(fā)現(xiàn)-969G/C、-1173C/T不是中國(guó)北方漢族人的SNP位點(diǎn)，NOS2A-969C位點(diǎn)的等位基因均為 T，NOS2A-1173C位點(diǎn)的等位基因均為G。

2.2 腦卒中組與對(duì)照組rs2779248位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 我們?cè)贜OS2A基因啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)到了rs2779248位點(diǎn)，并對(duì)該位點(diǎn)在腦卒中組與對(duì)照組的等位基因及基因型頻率進(jìn)行了比較。擬和優(yōu)度檢驗(yàn)表明病例組(χ2=0.015，P=0.903)和對(duì)照組(χ2=3.141，P=0.076)rs2779248 的基因型分布均未偏離H-W平衡。

2.3 腦卒中組與對(duì)照組rs2779248位點(diǎn)等位基因頻率比較 腦卒中組與對(duì)照組rs2779248位點(diǎn)等位基因頻率比較無(wú)明顯差異(P=0.889，χ2=0.019，見(jiàn)表1)。

2.4 腦卒中組與對(duì)照組rs2779248位點(diǎn)基因型頻率比較 腦卒中組與對(duì)照組rs2779248位點(diǎn)基因型頻率比較無(wú)明顯差異(P=0.889，χ2=0.019，見(jiàn)表2)。

表1 腦卒中組與對(duì)照組rs2779248位點(diǎn)等位基因頻率比較

表2 腦卒中組與對(duì)照組rs2779248位點(diǎn)基因型頻率比較

3 討論

一氧化氮(nitric oxide，NO)是生物體內(nèi)一種重要的信號(hào)分子，它是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化 L-精氨酸(L-arginin)轉(zhuǎn)化而成［5］，而NOS又分為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、內(nèi)皮型一氧化氮合酶以及神經(jīng)元型一氧化氮合酶3個(gè)亞型［6］。在動(dòng)脈粥樣硬化血管平滑肌細(xì)胞中iNOS表達(dá)及活性增加，可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的NO自由基，引起過(guò)氧化亞硝酸鹽形成增多、活性增加，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化和血管損傷，進(jìn)而引起血管內(nèi)皮功能障礙、炎性介質(zhì)釋放，加重血管炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。而動(dòng)脈粥樣硬化又是腦卒中發(fā)病的重要病理生理基礎(chǔ)，因此我們將編碼iNOS的NOS2A基因作為候選基因。

NOS2A 基因定位于17q11.2-q12，全長(zhǎng)37kb，包含26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子。已有研究表明iNOS基因多態(tài)性與潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、前列腺癌、胃癌等多種炎癥及免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)相關(guān)疾病有關(guān)［7］。針對(duì)NOS2A基因進(jìn)行的基因治療可明顯減小心肌梗死的體積［8］。杜丹華等對(duì)NOS2A基因多態(tài)性與腦卒中合并冠心病的關(guān)系進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)rs28944190位點(diǎn)C等位基因與腦卒中合并冠心病的發(fā)生存在相關(guān)性［9］。Hobbs等在坦桑尼亞和肯尼亞進(jìn)行的研究證實(shí)NOS2A基因啟動(dòng)子區(qū)-969G/C、-1173C/T變異可減輕瘧疾感染后癥狀的嚴(yán)重程度［10，11］。NOS2A 啟動(dòng)子區(qū)變異與原發(fā)性高血壓有關(guān)［5］。此外NOS2A基因是炎癥反應(yīng)通路中的一個(gè)關(guān)鍵基因。因此我們選擇NOS2A基因?yàn)楹蜻x基因，以-969G/C、-1173C/T位點(diǎn)為候選位點(diǎn)，采用啟動(dòng)子區(qū)全長(zhǎng)測(cè)序的方法探討NOS2A基因啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)NOS2A-969G/C、-1173C/T位點(diǎn)在中國(guó)北方漢族人中不存在變異，說(shuō)明SNPs在不同種族間存在差異。我們?cè)贜OS2A啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)到了rs2779248位點(diǎn)，關(guān)聯(lián)分析表明rs2779248位點(diǎn)與缺血性腦卒中無(wú)相關(guān)性。提示NOS2A基因啟動(dòng)子區(qū)與缺血性腦卒中的發(fā)病無(wú)明顯相關(guān)。

雖然本研究未發(fā)現(xiàn)NOS2A基因啟動(dòng)子區(qū)的常見(jiàn)變異與缺血性腦卒中的相關(guān)性，但在中國(guó)北方漢族人群NOS2A基因與高血壓、缺血性腦卒中嚴(yán)重程度等的關(guān)系還需要進(jìn)一步的探討。

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