PCR-熒光探針法檢測(cè)臨床痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的可靠性研究

梁建琴 高華方 李洪敏 趙智賢 張廣宇 王金河 王甦民 劉佳文

目前傳統(tǒng)的Mtb菌種鑒定和檢測(cè)方法如萋-尼染色、羅氏培養(yǎng)方法等，或靈敏度不高，易污染；或耗時(shí)長，易延誤診斷治療；或儀器設(shè)備昂貴，難于普遍開展。開發(fā)靈敏度高，耗時(shí)短，成本低廉易普及的檢測(cè)方法成為大勢(shì)所趨。而新近引入的PCR-熒光探針雜交技術(shù)靈敏度高、特異度高，成為研究的熱點(diǎn)。PCR-熒光探針雜交技術(shù)檢測(cè)臨床痰標(biāo)本，有研究報(bào)道其特異度和靈敏度均達(dá)到理想的水平，且檢測(cè)快捷方便。本研究通過PCR-熒光探針法（博奧生物有限公司，分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑）快速檢測(cè)和鑒別Mtb和非結(jié)核分枝桿菌（NT M），評(píng)價(jià)其在檢測(cè)臨床標(biāo)本中Mt b的應(yīng)用價(jià)值，有利于指導(dǎo)臨床開展早期有效的化療。

材料和方法

一、材料和試劑

1．患者情況：2009年1月至2010年12月解放軍第三〇九醫(yī)院、北京市老年病醫(yī)院和北京結(jié)核病控制研究所門診或住院診斷明確的患者1015例，其中，男性763例，女性252例，年齡19～86歲，平均年齡（46．8±12．3）歲，住院患者收集晨痰，門診患者收集即時(shí)痰液，所有患者均做過痰涂片或培養(yǎng)，結(jié)果見表1。其中非肺結(jié)核病患者痰標(biāo)本274例，包括肺癌患者92例、支氣管哮喘患者59例、慢性支氣管炎患者102例，支氣管擴(kuò)張患者21例，來源于解放軍第三〇九醫(yī)院165例和北京市老年病醫(yī)院109例；肺結(jié)核患者痰標(biāo)本741例，其中解放軍第三〇九醫(yī)院158例、北京市老年病醫(yī)院279例和北京結(jié)核病控制研究所304例。肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合參考文獻(xiàn)［1］，其中菌陽（痰涂片或痰培養(yǎng)陽性）肺結(jié)核265例，菌陰肺結(jié)核476例。凡是該階段參與該研究的檢驗(yàn)人員收集的痰標(biāo)本均為納入對(duì)象，進(jìn)行痰涂片和痰培養(yǎng)；另有1名參與該研究的技師對(duì)收集的痰標(biāo)本行PCR-熒光探針法檢測(cè)，并對(duì)對(duì)應(yīng)患者的診斷進(jìn)行追蹤，統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分組。

2．菌株材料：分枝桿菌臨床分離株56株，其中解放軍第三〇九醫(yī)院29株；北京市老年病醫(yī)院14株；北京結(jié)核病控制研究所13株。其中1株為Mtb，55株為NT M。分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 27294）由中國藥品生物制品檢定所提供。

3．試劑：分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑，博奧生物有限公司生產(chǎn)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，型號(hào)ABI7700，由博奧生物有限公司提供。Mt b核酸擴(kuò)增（PCR）熒光檢測(cè)試劑盒（目前臨床上認(rèn)可惟一同類產(chǎn)品）由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供。

二、方法

PCR具體操作步驟按照說明書進(jìn)行。PCR結(jié)束后，根據(jù)樣品所在反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Ct值）判斷是否存在Mt b或NT M，Ct值＜40，為陽性。FA M（綠色）通道陽性，VIC（黃色）通道陰性，為 Mt b；FA M通道陽性，VIC通道陽性，為Mtb；FA M通道陰性，VIC通道陽性，為NT M；FA M通道陰性，VIC通道陰性，無分枝桿菌。試驗(yàn)在解放軍第三〇九醫(yī)院、北京市老年病醫(yī)院和北京結(jié)核病控制研究所三家單位分別進(jìn)行。操作者均是經(jīng)過博奧生物有限公司統(tǒng)一培訓(xùn)的技術(shù)人員，結(jié)果由解放軍第三〇九醫(yī)院結(jié)核病研究所匯總形成研究總結(jié)報(bào)告。

對(duì)臨床醫(yī)生需要檢測(cè)報(bào)告的226份標(biāo)本進(jìn)行了達(dá)安公司試劑盒檢測(cè)。

對(duì)檢測(cè)結(jié)果與診斷不相符者、兩個(gè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果不一致者、檢測(cè)結(jié)果為NT M者，擴(kuò)增標(biāo)本送檢50～100μl到上海生物工程有限公司進(jìn)行16Sr DNA測(cè)序確認(rèn)。

三、評(píng)價(jià)項(xiàng)目

統(tǒng)計(jì)靈敏度（包括菌陽靈敏度和菌陰靈敏度）、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值等。并對(duì)該研究檢測(cè)結(jié)果和達(dá)安試劑盒（已經(jīng)上市）檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析，判斷差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四、評(píng)價(jià)方法

為便于分析統(tǒng)計(jì)，按照臨床診斷、培養(yǎng)或涂片結(jié)果和PCR-熒光探針法結(jié)果分為6組（表1）。菌陽肺結(jié)核熒光探針法陽性組（A組），菌陽肺結(jié)核熒光探針法陰性組（D組），菌陰肺結(jié)核熒光探針法陽性組（B組），菌陰肺結(jié)核熒光探針法陰性組（C組），非肺結(jié)核熒光探針法陽性組（E組），非肺結(jié)核熒光探針法陰性組（F組）。三家醫(yī)院分別對(duì)各自醫(yī)院的標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行達(dá)安試劑盒檢測(cè)，每個(gè)試驗(yàn)都是一次性的結(jié)果。計(jì)算PCR-熒光探針法試劑盒靈敏度（包括菌陽靈敏度和菌陰靈敏度）、特異度、陽性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值。陽性預(yù)測(cè)值（%）＝（真陽性例數(shù)／熒光探針法檢測(cè)陽性例數(shù)）×100%，陰性預(yù)測(cè)值（%）＝（真陰性例數(shù)／熒光探針法檢測(cè)陰性例數(shù)）×100%。

與達(dá)安公司試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行陽性符合率、陰性符合率、總符合率的比較，采用SPSS 11．5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PCR-熒光探針法直接檢測(cè)痰標(biāo)本結(jié)果

265例菌陽肺結(jié)核的痰標(biāo)本，應(yīng)用PCR-熒光探針法檢測(cè)出Mt b核酸陽性標(biāo)本252例，檢測(cè)陽性率為95．1%（252／265），檢測(cè)出 NT M 核酸陽性標(biāo)本5例，檢測(cè)陽性率1．9%（5／265），8例標(biāo)本檢測(cè)為陰性，菌陽檢測(cè)靈敏度為97．0%（257／265）；476 例菌陰肺結(jié)核的痰標(biāo)本中，應(yīng)用PCR-熒光探針法Mt b核酸陽性 110 例，檢出率為 23．1% （110／476），NT M 核酸陽性6例，檢出率為1．3%（6／476），菌陰肺結(jié)核標(biāo)本檢測(cè)靈敏度為24．4%（116／476）；274例非肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本中Mtb陽性標(biāo)本3例，假陽性率為1．1%（3／274），3例痰標(biāo)本經(jīng)16S r DNA 測(cè)序確認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。PCR-熒光探針法檢測(cè)痰標(biāo)本分枝桿菌靈敏度為50．3%（373／741），特異度為98．9%（271／274），陽性預(yù)測(cè)值 99．2%（373／376），陰性預(yù)測(cè)值42．4%（271／639）。1015份臨床痰標(biāo)本中共檢測(cè)出11份NT M核酸陽性標(biāo)本（占1．1%），經(jīng) 16S r DNA 測(cè)序確認(rèn)，準(zhǔn)確率為100．0%。1015份痰標(biāo)本統(tǒng)一編號(hào)，隨機(jī)數(shù)字量表法選取138份重復(fù)進(jìn)行PCR熒光探針法檢測(cè)，結(jié)果一致率100．0%（表1）。

二、PCR-熒光探針法檢測(cè)臨床分離株結(jié)果

對(duì)56份臨床分離株進(jìn)行檢測(cè)，1例Mt b核酸陽性，55例NT M核酸陽性，準(zhǔn)確率100．0%。

三、與達(dá)安公司試劑盒檢測(cè)比較結(jié)果

與達(dá)安公司試劑盒比較，該研究檢測(cè)結(jié)果的陽性符 合 率 為 92．4% （122／132），陰 性 符 合 率 為98．9%（93／94），總體符合率為95．1%［（93＋122）／226］，經(jīng)卡方分析，χ2＝2．98，P＝0．226，兩種檢測(cè)方法之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

與達(dá)安公司試劑盒比較，共有11例不符合標(biāo)本，其中10例為臨床診斷肺結(jié)核患者標(biāo)本。3例達(dá)安公司試劑盒檢測(cè)為Mt b陽性，博奧試劑盒檢測(cè)結(jié)果為NT M，16Sr DNA測(cè)序證實(shí)為NT M；1例為膿腫分枝桿菌，1例為戈登分枝桿菌，1例為偶發(fā)分枝桿菌。6例達(dá)安公司試劑盒檢測(cè)為Mtb，博奧檢測(cè)結(jié)果為分枝桿菌核酸陰性。1例博奧試劑盒檢測(cè)結(jié)果為Mt b核酸陽性，測(cè)序證實(shí)為Mt b，達(dá)安公司試劑盒檢測(cè)為陰性。另1例臨床診斷肺癌的標(biāo)本，達(dá)安公司試劑盒檢測(cè)為Mt b核酸陽性，博奧試劑盒檢測(cè)結(jié)果為陰性。

討 論

目前由于熒光定量PCR技術(shù)同時(shí)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、定量準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單易行等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于 Mt b的檢測(cè)［2-3］。本研究采用PCR-熒光探針法（博奧生物有限公司分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒）對(duì)1015例痰標(biāo)本和56株臨床分離株進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度為50．3%，特異度98．9%；并隨機(jī)抽取138例痰標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，符合率100．0%。隨機(jī)選取226例標(biāo)本，其中肺結(jié)核標(biāo)本220例，6例非結(jié)核痰標(biāo)本，與達(dá)安公司生產(chǎn)的Mt b檢測(cè)試劑盒就Mtb檢測(cè)項(xiàng)進(jìn)行比較，該研究檢測(cè)結(jié)果的陽性符合率為92．4%，陰性符合率為98．9%，總體符合率為95．1%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析（P＝0．226），兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于部分患者痰液量較少和經(jīng)費(fèi)不足等原因，本研究僅對(duì)臨床醫(yī)生需要檢測(cè)報(bào)告的226份標(biāo)本進(jìn)行了達(dá)安公司試劑盒檢測(cè)，下一步將開展PCR-熒光探針法檢測(cè)臨床痰標(biāo)本的大樣本、多中心評(píng)價(jià)，目前兩種試劑盒對(duì)其余800余份培養(yǎng)分離株的檢測(cè)正在進(jìn)行對(duì)比分析。

臨床工作中，痰菌陰性，經(jīng)臨床綜合分析后診斷為肺結(jié)核的患者，約占臨床肺結(jié)核患者的60%～70%［4］。有報(bào)道指出痰菌陰性的肺結(jié)核患者，如果未經(jīng)過抗結(jié)核治療，經(jīng)過1～3年的隨訪，將有40%～60%的患者發(fā)展為菌陽甚至更為典型的肺結(jié)核。所以，獲得病原學(xué)診斷至關(guān)重要。本研究利用博奧公司分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)476例臨床診斷菌陰肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)出Mt b核酸陽性110例，NT M核酸陽性6例，菌陰肺結(jié)核標(biāo)本檢測(cè)靈敏度為24．4%（116／476）。目前 PCR-熒光探針法直接用于菌陰肺結(jié)核痰標(biāo)本檢測(cè)的報(bào)道較少，肖海浩等［5］應(yīng)用抗酸染色涂片、Mt b培養(yǎng)、熒光定量PCR和噬菌體生物擴(kuò)增4種方法對(duì)68例菌陰肺結(jié)核患者的支氣管灌洗液進(jìn)行檢測(cè)，陽性率分別為29．4%、54．4%、33．8%和14．7%，認(rèn)為灌洗液涂片和熒光定量PCR對(duì)菌陰肺結(jié)核快速診斷具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。與本研究結(jié)果類似，提示PCR-熒光探針法可以作為臨床痰涂片和痰培養(yǎng)的補(bǔ)充，為臨床診斷和治療提供幫助。

表1 各組PCR-熒光探針法直接檢測(cè)痰標(biāo)本結(jié)果

表2 博奧試劑盒與達(dá)安公司試劑盒檢測(cè)Mtb結(jié)果的比較（例）

許多分枝桿菌16S r DNA序列是高度保守的，只在某些位置上存在少許核苷酸變化，這些核苷酸變化的位置是分枝桿菌屬或種特異的，已經(jīng)普遍用于分枝桿菌的菌種鑒定工作中［6］。本研究中應(yīng)用PCR-熒光探針法檢測(cè)出11例NT M核酸陽性標(biāo)本（1．1%），經(jīng)16Sr DNA 測(cè)序確認(rèn)，準(zhǔn)確率100．0%；對(duì)56株臨床分離株（1株Mt b臨床分離株，55株NT M臨床分離株）檢測(cè)，檢測(cè)準(zhǔn)確率100．0%。與達(dá)安公司試劑盒相比，有11例不符合標(biāo)本，在10例臨床診斷為肺結(jié)核患者的標(biāo)本中，達(dá)安公司試劑盒3例檢測(cè)為Mt b陽性的標(biāo)本，博奧檢測(cè)結(jié)果為NT M，并經(jīng)16Sr DNA測(cè)序證實(shí)為NT M；另外7例中6例達(dá)安公司試劑盒檢測(cè)為Mt b，博奧檢測(cè)結(jié)果為分枝桿菌核酸陰性，1例博奧試劑盒檢測(cè)結(jié)果為Mtb核酸陽性，達(dá)安公司試劑盒檢測(cè)為陰性，可能因?yàn)樘狄禾幚磉^程中核酸丟失出現(xiàn)的假陰性，或是操作過程中污染而呈現(xiàn)假陽性。274例非肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本，應(yīng)用PCR-熒光探針法檢測(cè)出Mtb核酸陽性標(biāo)本3例，假陽性率為1．1%（3／274），3例痰標(biāo)本經(jīng)16S r DNA測(cè)序確認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，其中1例臨床診斷為肺癌患者（病理證實(shí)為腺癌），用達(dá)安試劑盒檢測(cè)Mtb核酸陽性，判斷該患者同時(shí)合并Mtb感染；另外2例均為支氣管擴(kuò)張患者，追蹤患者病史和肺部CT，考慮2例患者不能排除結(jié)核性支氣管擴(kuò)張或者是合并Mtb感染的可能，需進(jìn)一步追蹤明確。

目前，已有大樣本結(jié)果顯示痰液熒光定量PCR檢測(cè)可獲得比涂片鏡檢明顯高的陽性率和略高于培養(yǎng)的陽性率，省時(shí)快速，是一種快速、敏感度高、特異度高的 Mtb輔助診斷方法，具有重要的應(yīng)用價(jià)值［7-8］。2010年賀松［9］的 Meta分析認(rèn)為，從現(xiàn)有的臨床證據(jù)來看，熒光定量PCR是檢測(cè)Mtb的有效方法，可推廣應(yīng)用于臨床結(jié)核病輔助檢測(cè)。與本研究結(jié)果一致。

以上分析表明，PCR-熒光探針法檢測(cè)Mt b和NT M簡(jiǎn)便可行，耗時(shí)短（僅需1 d時(shí)間），檢測(cè)靈敏度（50．3%）、特異度（98．9%）與抗酸染色（10%、30%）和培養(yǎng)法（30%、40%）相比［10-12］，靈敏度大大提高。本研究發(fā)現(xiàn)，博奧生物有限公司分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑與目前常用的達(dá)安公司檢測(cè)試劑盒相比，結(jié)果具有一定的可靠性，且同時(shí)可檢測(cè)和鑒別Mtb與NT M，國內(nèi)外未見類似報(bào)道。在臨床上可先行PCR-熒光探針法進(jìn)行初篩，對(duì)確定為NT M感染的患者可再進(jìn)一步行基因芯片雜交分析，可將分枝桿菌鑒定至種，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，縮短了檢測(cè)時(shí)間，對(duì)指導(dǎo)臨床意義重大。

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