單增李斯特菌免疫磁珠的制備研究

徐金亭，李志清，向軍儉，唐 勇，楊紅宇

（暨南大學(xué)分子免疫學(xué)與抗體工程研究中心，廣東廣州510632）

單增李斯特菌免疫磁珠的制備研究

徐金亭，李志清，向軍儉*，唐 勇，楊紅宇

（暨南大學(xué)分子免疫學(xué)與抗體工程研究中心，廣東廣州510632）

目的：制備可高效、特異地分離單增李斯特菌的免疫磁珠。探討羧基修飾磁珠與多克隆抗體的不同偶聯(lián)條件和免疫磁珠捕獲單增李斯特菌的能力。方法：以單增李斯特菌作為抗原，免疫新西蘭兔，獲得兔源多克隆抗體，鑒定其與單增李斯特菌體的結(jié)合能力；選擇6種不同的偶聯(lián)緩沖溶液，設(shè)置了6個主要偶聯(lián)時(shí)間和6組偶聯(lián)溫度，通過比較磁珠與抗體偶聯(lián)后上清中剩余的抗體量來確定最佳偶聯(lián)條件。結(jié)果：制備的多克隆抗體效價(jià)為1.3×105，該抗體與單增李斯特菌體有較好的結(jié)合，抗體與1mg羧基修飾磁珠在pH6.0的0.01mol/L一水嗎啉乙磺酸緩沖溶液（MES）中，37℃偶聯(lián)2h，偶聯(lián)抗體的量為160μg；制得的免疫磁珠的捕獲率可達(dá)77.0%。結(jié)論：獲得羧基磁珠與抗體偶聯(lián)的最佳條件，該免疫磁珠用于食品中單增李斯特菌的檢測，與常規(guī)的平皿增菌培養(yǎng)顯色法比較，檢測時(shí)間至少縮短20h。

免疫磁珠，單增李斯特菌，偶聯(lián)

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LMO）是一種分布廣泛的食源性致病菌，其幾乎可以污染所有的食物。因此在上世紀(jì)90年代，LMO被世界衛(wèi)生組織列為食品中四大致病菌之一[1]。目前現(xiàn)有針對LM的檢測方法有傳統(tǒng)分離培養(yǎng)與鑒定法，雙抗夾心ELISA法，PCR以及熒光量子點(diǎn)法等[2-4]。上述這些方法都涉及到樣品前處理過程，增菌培養(yǎng)是樣品前處理的重要步驟。該步驟耗時(shí)較長，而且容易受到樣品殘?jiān)约半s菌的影響。因此，建立一種快速、高效的樣品前處理方法，對用于食品中LMO以及其他致病菌的檢測具有重大的意義。免疫磁珠分離技術(shù)（Immunomagnetic separation）始于上世紀(jì)80年代，并獲得迅速的發(fā)展，已廣泛運(yùn)用于DNA提取、細(xì)胞分選、蛋白提取及純化和微生物分離檢測[5-7]。在微生物分離檢測中，免疫磁珠通過表面偶聯(lián)的抗體可以特異性的捕獲目標(biāo)物，起到分離、富集的作用。通過與其他檢測方法結(jié)合使用[8]，提高了檢測方法靈敏度的同時(shí)也實(shí)現(xiàn)檢測方法的快速、簡便及現(xiàn)場適用性。目前國內(nèi)對免疫磁珠的制備研究較少，而是用進(jìn)口試劑盒，成本較高。本研究運(yùn)用自制兔抗LMO純化的多抗與磁珠進(jìn)行偶聯(lián)制備免疫磁珠，探討并優(yōu)化抗體與磁珠偶聯(lián)的最佳條件，并用于捕獲試樣中的LMO菌體，以實(shí)現(xiàn)快速檢測食品中LMO。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新西蘭大白兔 購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；單增李斯特菌（菌株編號CMCC54002，簡稱LMO54002）由廣東微生物研究所提供；羧基修飾磁珠PM3－020上海奧潤微納新材料科技有限公司；BCATM protein試劑盒 美國Thermo公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑 美國Gibco公司；牛津瓊脂基礎(chǔ)OXA、OXA添加劑 青島海博生物技術(shù)有限公司；TSA－YE培養(yǎng)基廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；碳二亞胺（EDC） 美國Sigma公司；N－羥基琥珀酰亞胺（NHS） 美國Pierce公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

8孔磁性分離器 陜西北美基因股份有限公司；混勻儀Dynal－MIX1 美國Invitrogen公司；熒光倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司；UV－2550紫外－分光光度計(jì) Shimadzu公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；Biofuge primoR離心機(jī) 德國Heraeus公司；納米激光粒度儀 英國Malvern公司；透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡 荷蘭PHILIP公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗原的制備 將凍存的LMO菌種復(fù)蘇后，接種至100mL TSA－YE培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)24h，4500r/min離心15min收集菌體。用無菌生理鹽水洗滌兩次，然后加入含有0.3%甲醛的生理鹽水100mL，37℃滅活菌體24h。離心收集菌體，并以無菌生理鹽水重懸菌體。采用麥?zhǔn)媳葷岱▽w進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后分裝，－20℃凍存?zhèn)溆肹9－10]。

1.2.2 抗LMO多克隆抗體的制備及鑒定 新西蘭大白兔（雌雄各一只，2.0kg左右）適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，耳靜脈采血1～1.5mL，保留作為陰性血清。用滅活LMO全菌免疫新西蘭兔，每次免疫間隔兩周，免疫抗原體積為0.5mL，分多次背部皮下注射。初次免疫劑量為4×108CFU/只，以后四次免疫劑量逐漸加強(qiáng)，末次加強(qiáng)免疫劑量為3×109CFU/只[11]。每次免疫前一周耳緣靜脈采血，間接ELISA方法測定血清效價(jià)。末次免疫7d后頸動脈采集全部血液[12]。對獲得的兔抗血清采用辛酸－硫酸銨純化[13]。

1.2.3 磁珠性狀分析 采用納米激光粒度儀以及透射電子顯微鏡測量并觀察羧基磁珠（PM3－020）粒徑大小及其分布[14]。

1.2.4 羧基磁珠與抗體偶聯(lián)條件優(yōu)化

1.2.4.1 羧基磁珠與抗體偶聯(lián)步驟[14]活化：取100μL羧基修飾磁珠至1.5mL離心管中，用500μL 0.01mol/L一水嗎啉乙磺酸吐溫溶液（MEST，pH6.0，0.05%Tween－20）洗滌三次，用磁力架分離后吸出上清。用4℃貯存的0.01mol/L一水嗎啉乙磺酸溶液（MES，pH6.0）分別配制5mg/mL的碳二亞胺（EDC）和N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）溶液，向磁珠中分別加入100μL EDC和NHS溶液，置于混勻儀上保持磁珠懸浮，37℃活化45min，離心管置于磁力架上磁分離，移除上清，加入500μL MEST，將磁珠轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入500μL MEST，重新洗滌2次，最后移除上清。偶聯(lián)：將抗體與活化的磁珠混合，用偶聯(lián)緩沖液調(diào)節(jié)總體積至500μL，置于混勻儀上混勻活化磁珠和抗體懸液。封閉：將離心管取下置于磁力架上磁分離，移除上清，加入1mL 0.04mol/L含1%牛血清白蛋白（BSA）的硼酸鹽吐溫溶液（BST，pH9.0）重懸磁珠，置于混勻儀上37℃封閉45min。保存：取下離心管置于磁力架上磁分離，移除上清，磁珠用500μL BST洗滌四次，用含0.02%Na3N的保存緩沖液溶液重懸磁珠，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 偶聯(lián)緩沖液 取等量的活化磁珠，加入等量的抗體500μg，以六種緩沖液：磷酸鹽溶液（PBS，pH7.4）、磷酸鹽吐溫溶液（PBST，pH7.4，0.05%Tween－20）、一水嗎啉乙磺酸溶液（MES，pH6.0）、一水嗎啉乙磺酸吐溫溶液（MEST，pH6.0，0.05%Tween－20）、硼酸鹽溶液（BS，pH9.0）、硼酸鹽吐溫溶液（BST，pH9.0，0.05% Tween－20）構(gòu)成反應(yīng)體系，在37℃分別偶聯(lián)2h，每種緩沖液設(shè)置3個平行。最后用BCA試劑盒在OD570nm下檢測上清中剩余抗體的量，以確定抗體與磁珠偶聯(lián)的最佳偶聯(lián)緩沖液體系。

1.2.4.3 偶聯(lián)時(shí)間 取等量的活化磁珠于各離心管中，分別加入等量用偶聯(lián)緩沖液稀釋的抗體400μg，在37℃分別偶聯(lián)0.5、1、1.5、2、2.5、3h，保持磁珠處于懸浮狀態(tài)，每個時(shí)間設(shè)置3個平行。最后用BCA試劑盒檢測上清中剩余抗體的量，以確定抗體與磁珠偶聯(lián)的最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.4.4 偶聯(lián)溫度 取等量的活化磁珠，加入等量用偶聯(lián)緩沖液稀釋的抗體500μg，設(shè)定偶聯(lián)溫度為4、15、25、37、45、55℃，偶聯(lián)2h，保持磁珠處于懸浮狀態(tài)，每個溫度設(shè)置3個平行。最后用BCA試劑盒檢測上清中剩余抗體的量，以確定抗體與磁珠偶聯(lián)的最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.4.5 抗體偶聯(lián)量 取相同活化磁珠1mg，加入不同量的純化抗體50、100、200、400、500、800、1000、1500、2000、3000μg，在最佳緩沖體系中進(jìn)行偶聯(lián)。偶聯(lián)后用BCA法檢測上清剩余抗體量，由此獲得單位質(zhì)量磁珠偶聯(lián)抗體的量。

1.2.5 免疫磁珠（Immunomagnetic beads，IMBs）捕獲LMO

1.2.5.1 LMO與IMBs結(jié)合觀察 LMO增菌方法同1.2.1。用無菌生理鹽水10倍稀釋菌體為10－12。隨后取三份樣品，各為20μL，一份按傳統(tǒng)細(xì)菌計(jì)數(shù)方法涂布于顯色平皿，剩余二份用無菌生理鹽水稀釋至200μL，加入20μL免疫磁珠，保持免疫磁珠處于混勻狀態(tài)，37℃孵育45min。將離心管置于磁力架上，去除上清后將免疫磁珠轉(zhuǎn)移至新離心管中，并用含0.1%牛血清白蛋白的0.01mol/L PBS緩沖液洗滌三次。最后用20μL PBS緩沖液重懸免疫磁珠，其中一份用于掃描電子顯微鏡觀察，另一份涂于顯色平皿，置于37℃烘箱中培養(yǎng)18h，取出觀察。統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)。

1.2.5.2 單位量IMBs的捕獲能力 用無菌生理鹽水稀釋菌體至10－7～10－12，分別取100μL菌液，并向其中加入制備的IMBs20μL。按上述磁珠分離法分離后，用20μL PBS緩沖液重懸免疫磁珠，涂顯色平皿，置于37℃烘箱中培養(yǎng)18h，取出觀察。統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 多克隆抗體效價(jià)

新西蘭兔經(jīng)五次免疫后，用間接ELISA檢測其效價(jià)，以多克隆抗體的吸光值2.1倍于陰性血清吸光值時(shí)，多克隆抗體的最大稀釋倍數(shù)為其效價(jià)[9]。由圖1可知多克隆抗體的效價(jià)約為1.3×105。

圖1 多克隆抗體效價(jià)曲線Fig.1 Titer curve of polyclonal antibody

2.2 多抗與LMO菌體的結(jié)合

為探討該多抗能與LMO菌體特異性結(jié)合，在多抗與LMO菌體孵育1h后，使用FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗處理，然后在熒光顯微鏡下觀察LMO菌體的發(fā)光情況。結(jié)果顯示，多抗能與LMO菌體有較好的特異性結(jié)合，見圖2。

圖2 多抗與LMO菌體結(jié)合Fig.2 Combination of the polyclonal antibody and Listeria monocytoenes

2.3 磁珠粒徑檢測

圖3 羧基磁珠PM3－020 TEM掃描圖（17500×）Fig.3 TEM of carboxylate－modified magnetic beads（17500×）

用激光粒度儀對羧基磁珠粒徑進(jìn)行測量。粒徑測試條件為：25℃。磁珠在分散緩沖液中的濃度為0.2mg/mL。結(jié)果表明，羧基修飾磁珠PM3－020的粒徑分布較為均勻，其平均粒徑為175nm，分散指數(shù)（PDI）為0.236。同時(shí)用透射電子顯微鏡（TEM）觀察PM3－020。從圖3可以看出，該磁珠有較好的分散性，且磁珠大小較為均勻。

2.4 羧基磁珠與抗體偶聯(lián)條件優(yōu)化

2.4.1 最佳偶聯(lián)緩沖體系 圖4結(jié)果顯示，MES緩沖液體系的OD570值要低于PBS和BS緩沖液體系，說明在MES緩沖液體系中，上清剩余抗體量少于其他兩種緩沖液中的抗體剩余量，即表明磁珠偶聯(lián)上抗體的量在MES緩沖液體系中達(dá)到最大。另外，在三種相同的緩沖液中，加入Tween－20后，OD570均大于不加Tween－20的緩沖體系，說明Tween－20對磁珠與抗體偶聯(lián)起抑制作用。因此最佳的活化磁珠與抗體偶聯(lián)的緩沖體系為MES緩沖液（0.01mol/L，pH6.0）。

圖4 緩沖液對偶聯(lián)效果的影響Fig.4 Effect of buffer on coupling

2.4.2 偶聯(lián)時(shí)間 活化磁珠與抗體經(jīng)過不同偶聯(lián)時(shí)間后，用BCA試劑盒在OD570檢測上清中剩余抗體的含量，結(jié)果如圖5。偶聯(lián)時(shí)間在0.5～1.5h內(nèi)時(shí)，上清剩余抗體量遞減迅速，當(dāng)超過2h后，上清抗體量趨向穩(wěn)定，說明偶聯(lián)到磁珠上的抗體達(dá)到飽和。因此，選擇2h作為活化磁珠與抗體的偶聯(lián)時(shí)間。

圖5 時(shí)間對偶聯(lián)效果的影響Fig.5 Effect of time on coupling

2.4.3 偶聯(lián)溫度 圖6結(jié)果顯示，在4～15℃內(nèi)，OD570變化不明顯，說明活化磁珠與抗體偶聯(lián)受到抑制，且在實(shí)驗(yàn)中觀察到磁珠發(fā)生聚集，形成肉眼可見的褐色顆粒狀沉淀，見圖7B；在15～37℃，OD570變化加劇，說明偶聯(lián)到磁珠上的抗體量增加；當(dāng)溫度超過37℃，OD570變化再次趨向穩(wěn)定，表明磁珠表面偶聯(lián)上的抗體量達(dá)到飽和，由此選擇37℃作為偶聯(lián)的最適溫度，同時(shí)37℃也是抗體保持較好活性的最佳溫度，制得的免疫磁珠在溶液中分散性好，且具有較好的穩(wěn)定性（圖7A）。

2.4.4 單位磁珠抗體偶聯(lián)量 由上述確定磁珠與抗體偶聯(lián)的最佳偶聯(lián)時(shí)間、溫度和緩沖液，摸索單位質(zhì)量磁珠偶聯(lián)抗體的量，結(jié)果如圖8所示。當(dāng)加入的抗體量在50～400μg之間時(shí)，1mg活化磁珠偶聯(lián)上的抗體量逐漸增加，當(dāng)加入的抗體量大于500μg時(shí)，偶聯(lián)至活化磁珠上的抗體趨向飽和，此時(shí)1mg磁珠偶聯(lián)上的抗體量為160μg。

圖6 溫度對偶聯(lián)效果的影響Fig.6 Effect of temperature on coupling

圖7 溫度對偶聯(lián)效果的影響Fig.7 Effect of temperature on coupling

圖8 加入抗體量對偶聯(lián)效果的影響Fig.8 Effect of antibodies amount on coupling

2.5 IMBs捕獲LMO

圖9 免疫磁珠與菌體作用SEM掃描圖Fig.9 SEM of combination between immunomagnetic beads and Listeria monocytoenes

2.5.1 IMBs捕獲LMO觀察 將制備得到的IMBs與LMO菌體作用后，用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察兩者的結(jié)合情況，結(jié)果見圖9。SEM掃描圖顯示，粒徑為200nm左右的IMBs通過其表面的抗體與LMO菌體牢固的結(jié)合，說明制備的IMBs能捕獲到LMO。觀察平皿LMO的生長狀況。20μL稀釋菌液直接涂布平皿后，觀察到的LMO菌落數(shù)為39個，而用無菌生理鹽水稀釋十倍，再用制備的免疫磁珠捕獲，觀察到的LMO菌落數(shù)為30個。由此可知20μL免疫磁珠的捕獲率為77%。2.5.2 單位量IMBs捕獲能力 在10倍稀釋的100μL LMO菌液中，加入20μL制備的IMBs，經(jīng)18h培養(yǎng)后，其捕獲的LMO菌體數(shù)見圖10。從圖中可知，當(dāng)LMO菌體數(shù)量增加時(shí)，20μL IMBs捕獲菌體的量也逐漸增加，并在LMO菌體稀釋倍數(shù)為10－10時(shí)，其捕獲的LMO菌體能力趨于飽和，其捕獲到的菌體數(shù)目在165～174個之間。因此，20μL IMBs捕獲LMO的最大量為174。

圖10 免疫磁珠捕獲能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.10 The capture ability of immunomagnetic beads

3 討論

免疫磁珠分離技術(shù)已廣泛運(yùn)用于食品中食源性致病菌的分離檢測，已有文獻(xiàn)報(bào)道在大腸桿菌O157∶H7檢測中運(yùn)用免疫磁珠，其檢測時(shí)間可以縮短到1.5h[15]。2008年中國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布的進(jìn)出口食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測方法中明確提出采用免疫磁珠分離技術(shù)作為樣品的前處理方法[16]。由此可見免疫磁珠分離技術(shù)在今后食品安全檢測中將發(fā)揮重要作用。目前只有Invitrogen公司市售抗LMO免疫磁珠試劑盒，且價(jià)格相對昂貴。本研究探索了抗LMO免疫磁珠制備的最佳條件及免疫磁珠捕獲菌體的效率。

通過激光粒度儀分析，選擇粒徑分布均勻且分散性好的羧基磁珠作為制備免疫磁珠的材料。磁珠與抗體偶聯(lián)所選用的緩沖體系及其pH，偶聯(lián)的時(shí)間和溫度直接影響磁珠與抗體的偶聯(lián)效果以及制備的免疫磁珠的捕獲能力。本研究表明，在MES緩沖液中（pH6.0），抗體偶聯(lián)至磁珠表面的量最大，因?yàn)轸然胖樵谄嵝缘沫h(huán)境下，保持較好的分散性，磁珠的比表面積也最大化。同時(shí)證明，在偶聯(lián)2h時(shí)即完成抗體偶聯(lián)的最大化。在偶聯(lián)溫度實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，較低的偶聯(lián)溫度不利于抗體與磁珠的偶聯(lián)，且會出現(xiàn)磁珠的聚集，形成顆粒狀沉淀，影響免疫磁珠的保存及使用。當(dāng)溫度超過37℃，抗體偶聯(lián)量趨于穩(wěn)定。在上述探索的偶聯(lián)條件下，1mg磁珠可以偶聯(lián)160μg抗體。

本實(shí)驗(yàn)將制備的抗LMO免疫磁珠與常規(guī)的平皿培養(yǎng)顯色法結(jié)合，檢測時(shí)間至少縮短20h，免疫磁珠的捕獲率可達(dá)77%。目前本實(shí)驗(yàn)室正在探討定量的免疫磁珠在大體積實(shí)樣中的捕菌能力并建立與化學(xué)顯色法結(jié)合的檢測技術(shù)，為LMO快速、靈敏和特異的檢測技術(shù)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

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Study on preparation of immunomagnetic beads used for Listeria monocytoenes separation

XU Jin-ting，LI Zhi-qing，XIANG Jun-jian*，TANG Yong，YANG Hong-yu
（Antibody Engineering Center，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Objective：To prepare the immunomagnetic beads which separated Listeria monocytogenes efficiently and specifically，and to investigate the optimal conditions of coupling reaction for carboxylate-modified magnetic beads and polyclonal antibody，and to evaluate the capture capacity of immunomagnetic beads. Methods：The cell of Listeria monocytogenes was used as antigen for immunization of rabbit to prepare polyclonal antibody and binding affinity between polyclonal antibody，and Listeria monocytogenes was determined.Three main options were set：6 different coupling buffers，6 main coupling time and 6 groups coupling temperature.The optimal coupling conditions were obtained by comparing the antibody surplus of supernatant after coupling.Results：The titer of purified polyclonal antibody which had high binding affinity with Listeria monocytoenes was about 1.3×105.With the coupling buffer of 0.01mol/L 2-（N-Morpholino）ethanesulfonicacid（MES，pH6.0），purified polyclonal antibody was coupled with 1mg carboxylate-modified magnetic beads for 2h at 37℃，and the amount of coupled antibody was 160μg.The capture ratio of newly produced immunomagnetic beads was about 77%.Conclusion：The optimal conditions of coupled reaction were achieved and the immunomagnetic beads were prepared successfully.Comparing with the traditional culture-based methods，the entire procedure for listeria monocytogenes detection could be reduced at least 20 hours prepared with immunomagnetic beads.

immunomagnetic beads；Listeria monocytoenes；coupling

TS201.3

A

1002-0306（2012）05-0323-05

2011－04－06 *通訊聯(lián)系人

徐金亭（1985-），男，碩士研究生，研究方向：食品安全檢測。

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009B030803010）。