檢測乳粉中克羅諾桿菌屬穆汀斯克羅諾桿菌的雙抗夾心ELISA方法的研究

石 曼，生 威，杜欣軍，王 帥，楊 麗，余桂春，郭柏雪，王 碩

（食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

檢測乳粉中克羅諾桿菌屬穆汀斯克羅諾桿菌的雙抗夾心ELISA方法的研究

石 曼，生 威，杜欣軍，王 帥，楊 麗，余桂春，郭柏雪，王 碩*

（食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

獲得了抗穆汀斯克羅諾桿菌的多克隆抗體，抗體只對穆汀斯克羅諾桿菌菌株有特異性識別，而對非穆汀斯克羅諾桿菌無交叉反應(yīng)。利用所得到的抗體，建立了一種雙抗夾心ELISA檢測方法，該方法對純培養(yǎng)穆汀斯克羅諾桿菌菌液檢出限為105cfu/mL；經(jīng)過17h增菌，全脂乳粉染菌樣品中的穆汀斯克羅諾桿菌的檢出限為0.1cfu/g。該方法為快速檢測乳粉中穆汀斯克羅諾桿菌的污染奠定了基礎(chǔ)。

穆汀斯克羅諾桿菌，雙抗夾心ELISA，全脂乳粉，檢測

阪崎腸桿菌（Cronobacter spp.）是一種革蘭氏陰性菌，1980年以日本細(xì)菌學(xué)家Riichi Sakazakii的名字命名，即阪崎腸桿菌（Enterobacter Sakazakii）[1]。2008年Iersen把阪崎腸桿菌生物群另外分為腸桿菌科的一個(gè)新屬Cronobacter spp.，該屬包含5個(gè)種，1個(gè)基因種，3個(gè)新亞種，分類關(guān)系見表1[2]。2008年第三十一屆食品衛(wèi)生法典委員會建議暫時(shí)同時(shí)使用兩種命名：Enterobacter sakazakii（Cronobacter屬）。阪崎腸桿菌感染死亡率高達(dá)20%～50%[3-4]。配方奶粉是主要的感染源[5-6]。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)檢測步驟繁瑣，檢出時(shí)間長，ELISA使致病菌的快速檢測有了較大的發(fā)展。本研究以穆汀斯克羅諾桿菌ATCC51329為免疫原，制備出了高效價(jià)、高特異性的抗血清，并建立了檢測穆汀斯克羅諾桿菌的夾心ELISA方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗兔IgG抗體、TMB、過氧化氫脲 Sigma公司；Protein A-Sepharose 4B 美國Amersham公司；穆汀斯克羅諾桿菌ATCC51329（C.muytjensii）、阪崎克羅諾桿菌ATCC29544（C.sakazakii） 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；阪崎克羅諾桿菌IQCC10422（C.sakazakii） 中國檢科院食品安全微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC8739、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）TJCIQENT6926、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）ATCC12453、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）TJCIQ51175、成團(tuán)腸桿菌（Enterobacter agglomerans）TJCIQ090929、腸炎沙門菌（Salmonella enteritidis）TJCIQ50041、弗氏枸櫞檬酸桿菌（Citrobacter freundii）TJCIQCIT6926 天津出入境檢驗(yàn)檢疫局贈送。

酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；蛋白純化儀 美國BIO-RAD公司；分析天平-BL610 賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；96孔酶標(biāo)板 丹麥Nunc公司；洗板機(jī) 美國BIO-RAD公司；微量可調(diào)移液器 法國GILSON公司。

表1 克羅諾桿菌新屬（Cronobacter spp.）組成和分類關(guān)系Table 1 Composition and classification of Cronobacter spp.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備免疫原 取新鮮無菌的改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素液體培養(yǎng)基（mLST-Vm）接種穆汀斯克羅諾桿菌ATCC51329，搖床上180r/min，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。平板計(jì)數(shù)。菌體用1.5%福爾馬林滅活，收集菌體，用無菌生理鹽水離心（5000r/min，10min）洗滌兩次，將重懸后的菌液比濁并稀釋至1010cfu/mL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抗體制備、純化及效價(jià)的測定 首次免疫以1mL濃度為109cfu/mL的菌液與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，采取皮下和肌肉注射法免疫雄性新西蘭大耳白兔。加強(qiáng)免疫用1mL濃度為109cfu/mL的菌液與等體積弗氏不完全佐劑充分乳化多點(diǎn)皮內(nèi)和肌肉注射。分別于初次免疫后2、4、6周共加強(qiáng)免疫3次，于第二次免疫后7d，由兔子的耳緣靜脈取血，進(jìn)行效價(jià)測定。最后一次加強(qiáng)免疫后1周，取全血。采用以Protein A-Sepharose 4B作親合層析介質(zhì)純化抗血清，并測定純化后抗體濃度。

采用間接ELISA法檢測抗穆汀斯克羅諾桿菌兔多克隆抗血清效價(jià)。在96孔板中包被107cfu/mL熱滅活穆汀斯克羅諾桿菌（100μL/孔），37℃孵育2h。PBST洗板3次，封閉液（200μL/孔）37℃封閉30min。PBST洗板3次，加入梯度稀釋的抗血清（100μL/孔）37℃孵育1h。PBST洗板4次，加入酶標(biāo)二抗（100μL/孔）37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入TMB底物溶液（100μL/孔）37℃孵育20min。加入1.25mol/L濃硫酸50μL/孔終止反應(yīng)。選擇吸光度值在0.7～1.2范圍內(nèi)的抗血清的稀釋倍數(shù)，即為抗血清效價(jià)。

1.2.3 酶標(biāo)抗體制備 過碘酸鈉法[7]制備酶標(biāo)抗體：5mg HRP溶于0.5mL雙蒸水，加入1mL新配制的0.06mol/L NaIO4，4℃混勻30min。加入0.16mol/L乙二醇0.6mL，4℃混勻30min，終止氧化反應(yīng)。加入5mg抗體，混勻并裝入透析袋，置0.05mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液1000mL中，4℃透析6～12h，換液3次，使之結(jié)合。取出透析袋中液體（約3mL），加入5mg/mL NaBH40.2mL 4℃緩慢混勻2h。飽和硫酸銨沉淀法純化后沉淀物復(fù)溶于1mL PBS，4℃透析6～12h，換液3次。取出后加入等體積甘油，-20℃保存。

1.2.4 雙抗夾心ELISA檢測方法的建立 雙抗夾心ELISA法檢測穆汀斯克羅諾桿菌：在聚苯乙烯酶標(biāo)板上包被濃度為0.5μg/mL的抗穆汀斯克羅諾桿菌兔多克隆抗體（100μL/孔），37℃孵育2h。PBST洗板3次，采用0.5%脫脂乳粉/PBS（200μL/孔）封閉30min。PBST洗板3次，加入梯度稀釋的穆汀斯克羅諾桿菌（100μL/孔），室溫孵育1h。PBST洗板4次，加入1∶2000酶標(biāo)記的抗穆汀斯克羅諾桿菌兔多克隆抗體（100μL/孔），室溫反應(yīng)30min。PBST洗板5次加入TMB底物溶液（100μL/孔），37℃反應(yīng)20min。加入1.25mol/L濃硫酸50μL/孔終止反應(yīng)。以（測定孔OD值-空白值）/（陰性對照孔OD值-空白值）≥2.1，即OD值大于陰性對照孔2.1倍判為陽性。

1.2.5 雙抗夾心ELISA檢測穆汀斯克羅諾桿菌的靈敏度和特異性 將穆汀斯克羅諾桿菌以PBS（pH7.4）稀釋至103、104、105、106、107、108cfu/mL的不同濃度作為抗原，檢測雙抗夾心ELISA法的靈敏度。大腸桿菌等不同菌株接種于mLST-Vm培養(yǎng)15h，菌懸液計(jì)數(shù)后沸水浴10min，以上述不同抗原作為待測抗原，確定雙抗夾心ELISA檢測的特異性。

1.2.6 人工接種全脂乳粉的檢測 全脂乳粉是天津進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫局贈送的不含穆汀斯克羅諾桿菌的陰性樣。全脂乳粉樣品的制備：無菌條件下，稱取全脂乳粉10g，接入穆汀斯克羅諾桿菌不同濃度的菌懸液，按10、1、0.1cfu/g樣品接種量接種，并以無菌生理鹽水作陰性對照。在上述各樣品中加入90mL mLSTVm，混勻，37℃，轉(zhuǎn)速180r/min的恒溫?fù)u床上分別增菌培養(yǎng)11、14、17、20h后取樣檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 穆汀斯克羅諾桿菌多克隆抗體效價(jià)的測定

圖1 純化后抗體效價(jià)Fig.1 The titer of antibody after purification

間接ELISA對純化后的抗穆汀斯克羅諾桿菌抗體進(jìn)行效價(jià)測定，結(jié)果如圖1，多克隆抗體效價(jià)很高，效價(jià)達(dá)到1∶80000。

2.2 雙抗夾心ELISA法檢測的靈敏度

以穆汀斯克羅諾桿菌純培養(yǎng)菌液系列稀釋，測定雙抗夾心ELISA方法的靈敏度結(jié)果如圖2，結(jié)果表明，隨抗原濃度增大，OD值顯著增大，該方法對105cfu/mL穆汀斯克羅諾桿菌純培養(yǎng)菌液檢測結(jié)果的OD值之比為6.01，而103cfu/mL和104cfu/mL的比值都小于2.1，因此，得出雙抗夾心ELISA對穆汀斯克羅諾桿菌純培養(yǎng)菌液的檢出限為105cfu/mL，從加入待測抗原到得出結(jié)果只需要3h。

圖2 雙抗夾心ELISA檢測穆汀斯克羅諾桿菌的靈敏度Fig.2 Sensitivity of detecting C.muytjensii by double-antibody sandwich ELISA

2.3 雙抗夾心ELISA的特異性檢測

選取穆汀斯克羅諾桿菌及其他菌株作為抗原用來檢測雙抗夾心ELISA的特異性，結(jié)果如圖3。結(jié)果表明穆汀斯克羅諾桿菌呈顯著陽性反應(yīng)，吸光值與陰性孔值之比為6.01，大腸桿菌等其它菌株均呈陰性反應(yīng)，吸光值與陰性孔值比均小于2.1，即抗體同非穆汀斯克羅諾桿菌沒有交叉反應(yīng)，說明雙抗夾心ELISA方法對穆汀斯克羅諾桿菌具有很高的檢測特異性。

圖3 雙抗夾心ELISA檢測穆汀斯克羅諾桿菌的特異性Fig.3 Specificity of detecting C.muytjensii by double-antibody sandwich ELISA

2.4 人工接種全脂乳品的檢測

表2 增菌后雙抗夾心ELISA檢測穆汀斯克羅諾桿菌結(jié)果Table 2 The results of detecting C.muytjensii by doubleantibody sandwich ELISA after enrichment

按10、1、0.1cfu/g三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)接種量分別接種穆汀斯克羅諾桿菌在全脂乳粉中，染菌樣品經(jīng)過37℃、180r/min選擇性增菌11、14、17、20h后，分別取1mL用于雙抗夾心ELISA檢測。結(jié)果表明，樣品在增菌14h時(shí)取樣檢測，10、1cfu/g樣品接種量接種的樣品檢測結(jié)果呈陽性，0.1cfu/g樣品接種量接種的樣品無法檢測到穆汀斯克羅諾桿菌的存在，17h時(shí)取樣檢測，10、1、0.1cfu/g樣品接種量接種的樣品檢測均為陽性。

3 結(jié)論

本研究獲得的抗穆汀斯克羅諾桿菌兔多克隆抗體純化后效價(jià)為1∶80000。建立的雙抗夾心ELISA方法穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，對純培養(yǎng)菌液檢出限為105cfu/mL，對2株阪崎腸桿菌屬內(nèi)菌株和7株非阪崎腸桿菌菌株都沒有交叉反應(yīng)，說明抗體特異性好。由于穆汀斯克羅諾桿菌主要存在于乳制品中，所以選擇對全脂乳粉人工接種穆汀斯克羅諾桿菌并以雙抗夾心ELISA方法檢測，檢測結(jié)果顯示，經(jīng)過17h的增菌過程，不同接種量的接種樣品（10、1、0.1cfu/g樣品接種量）都可以被檢測到穆汀斯克羅諾桿菌的存在，延長培養(yǎng)時(shí)間對于檢測結(jié)果無意義。相對與傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測方法，該ELISA方法檢測快速、靈敏度高、特異性好，為乳粉檢驗(yàn)提供了一種新方法，為快速檢測穆汀斯克羅諾桿菌奠定了基礎(chǔ)，有很好的應(yīng)用前景。

[1]Farmer J J，Asbury M A，Brenner D J，et al.Enterobacter sakazakii：a new species of“Enterobacteriaceae”isolated from clinical specimens[J].InternationalJournalof Systematic Bacteriology，1980，30：569-584.

[2]Iversen C，Mullane N，Barbara M，et al.Cronobacter gen. nov.，a new genus to accommodate the biogroups of Enterobacter sakazakii，and proposal of Cronobacter sakazakii gen.nov.comb. Nov.，C.malonaticus sp.Nov.，C.turicensis sp.Nov.，C.muytjensii sp.Nov.，C.dublinensis sp.Nov.，Cronobacter genomospecies 1，and of three subspecies，C.dublinensis sp.Nov.subsp.dublinensis subsp.Nov.，C.dublinensis sp.Nov.subsp.lausannensis subsp. Nov.and C.dublinensis sp.Nov.subsp.Lactaridi subsp.Nov.[J]. Int J Systematic and Evolutionary Microbiol，2008，58：1442-1447.

[3]Nazarowec-White M，F(xiàn)arber J M.Enterobacter sakazakii：a review[J].International Journal of Food Microbiology，1997，34（2）：103-113.

[4]Corti G，Panunzi I，Losco M，et al.Postsurgical osteomyelitis caused by Enterobacter sakazakii in a healthy young man[J]. Journal of Chemotherapy，2007，19（1）：94-96.

[5]Drudy D，Mullane N R，Quinn T，et al.Enterobacter sakazakii：An emerging pathogen in powdered infant formula[J].Clinical Infectious Diseases，2006（42）：996-1002.

[6]GurtlerJB，KornackiJ L，Beuchat L R.Enterobacter sakazakii：A coliform of increased concern to infant health[J].International Journal of Food Microbiology，2005，104：1-34.

[7]馮仁清，郭振泉，宓捷波.現(xiàn)代抗體技術(shù)及其應(yīng)用[M].北京：北京大學(xué)出版社，2006.

Development of a double-antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay for detection of Cronobacter muytjensii in milk powder

SHI Man，SHENG Wei，DU Xin-jun，WANG Shuai，YANG Li，YU Gui-chun，GUO Bai-xue，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The polyclonal antibody（PcAb）for Cronobacter muytjensii was available by intravenous injection with New Zealand rabbit with C.muytjensii ATCC51329 strains，a double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was developed.The detection limits were 105cfu/mL in pure culture of C.muytjensii ATCC51329 and without any cross reaction with the non-C.muytjensii strains.With 17h enrichment procedure，C.muytjensii recovered well from inoculated whole milk powder at levels of 0.1cfu/g.The results demonstrated that the double-antibody sandwich ELISA was a sensitive and specific method for detecting C.muytjensii in dairy products.

C.muytjensii；double-antibody sandwich ELISA；whole milk powder；detect

TS252.7

A

1002-0306（2012）01-0335-03

2011－01－11 *通訊聯(lián)系人

石曼（1986-），女，碩士，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。

“十一五”科技支撐課題計(jì)劃資助項(xiàng)目（2009BADB9B03，2009BADB9B06）；天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（10SYSYJC28300）。