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    牛奶過敏原PCR檢測(cè)方法的建立

    2012-11-15 02:04:18許慶金鄧志瑞張文舉
    食品工業(yè)科技 2012年6期
    關(guān)鍵詞:純牛奶羊奶保質(zhì)期

    許慶金,鄧志瑞,張文舉,陳 沁

    (上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海200444)

    牛奶過敏原PCR檢測(cè)方法的建立

    許慶金,鄧志瑞,張文舉,陳 沁*

    (上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海200444)

    牛奶是主要的食品過敏原之一,其中β-乳球蛋白是引起牛奶過敏的主要成分?;谂D苔拢榍虻鞍谆蛐蛄性O(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物,經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立了適合檢測(cè)牛奶β-乳球蛋白過敏原的PCR方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)PCR反應(yīng)體系中模板DNA量為25ng,引物濃度為4mmol/L時(shí),檢測(cè)效果最佳。所建立的方法不僅可用于不同保質(zhì)期、不同來源牛奶β-乳球蛋白過敏原的測(cè)定,亦可用于牛、羊奶不同比例混合物中β-乳球蛋白過敏原的檢測(cè)。

    β-乳球蛋白,PCR,牛奶過敏原

    食物過敏(food allergy)是食物刺激有機(jī)體產(chǎn)生的變態(tài)反應(yīng)[1],微小的劑量即可在幾分鐘之內(nèi)引起皮膚以及腸道等的疾病,嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致休克死亡。發(fā)達(dá)國家每年有超過20%的人受過敏性疾病的困擾。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO,995)報(bào)告的八類主要的過敏原食物是牛奶、雞蛋、魚、甲殼類(蝦、蟹)、大豆、花生、核果類(杏、板栗、腰果)以及小麥。牛奶是其中最常見的過敏原之一,在小于3歲的嬰幼兒中發(fā)病率為1.6%~2.8%[2]。而β-乳球蛋白是牛奶致敏的主要成分[3]。牛奶過敏已引起社會(huì)的關(guān)注,日本、澳洲和西方國家要求含有牛奶成分的食品必須標(biāo)明牛奶過敏標(biāo)示[4-5]。目前,牛奶過敏原的檢測(cè)方法主要有基于蛋白質(zhì)檢測(cè)的SDS-PAGE、HPLC和HPLC-MS等[6-7]。這些方法本可直接檢測(cè)到過敏原蛋白,但在食品加工過程中,蛋白質(zhì)空間構(gòu)象易被破壞,從而影響檢測(cè)準(zhǔn)確性,目前已有研究證實(shí)變性后的部分蛋白可與抗體結(jié)合引起假陽性[8-9];此外,上述方法存在檢測(cè)周期較長、不穩(wěn)定因素多、工作量大等缺點(diǎn)[10]。PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的成功應(yīng)用在一定程度上可解決上述問題。鑒于此,本文針對(duì)牛奶中引起過敏的β-乳球蛋白對(duì)應(yīng)的基因序列設(shè)計(jì)引物,擬建立檢測(cè)牛奶過敏原的PCR方法。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    牛奶和羊奶 好又多超市;dNTPs、Taq酶和10 ×PCP buffer(Mg2+plus) 天根生物科技(北京)有限責(zé)任公司;引物 由上海生工生物工程有限公司合成;TEN溶液 1mL Tris-HCl溶液(1mol/L,pH 7.4)+0.2mL EDTA溶液(0.5mol/L)+0.5844g NaCl固體,定容至100mL;其他試劑 按常規(guī)方法配制。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 DNA的提取 牛奶DNA的提取參照徐仙等[11]、田雨[12]及Sharma D等[13]的方法,稍作修改。

    a.取35mL牛奶(羊奶)置于50mL潔凈的離心管中,4℃,3000r/min離心10min,棄上清液,在超凈臺(tái)中用脫脂棉球小心拭去管壁上的脂類物質(zhì);b.加10mL PBS溶液,溶解沉淀,4℃,3000r/min離心10min,棄上清液,再次在超凈臺(tái)中用脫脂棉球小心去脂;c.4℃,10000r/min離心1min,去上清液;d.加440μL TEN溶液和60μL NaOH溶液,轉(zhuǎn)入無菌的 Eppendorf管(1.5mL)中,置于95℃條件下8min,冷卻5min,4℃,10000r/min離心 5s,轉(zhuǎn)移上清至新的無菌的Eppendorf管(1.5mL)中;e.加等體積SEVGA(氯仿∶異戊醇 =24∶1),混合混勻,4℃,12000r/min離心10min,取上清液;f.加等體積(-20℃)預(yù)冷的異丙醇,-20℃放置40min,13000r/min離心15min,棄上清液;g.加300μL 70%乙醇,12000r/min離心5min,去上清液;h.加50μL雙蒸水,測(cè)DNA濃度和純度,分裝,低溫(-20℃)保存。

    1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì) 針對(duì)牛β-乳球蛋白基因設(shè)計(jì)引物 FCM/RCM,序列見表 1,目的條帶大小為1.8kb。

    1.2.3 PCR反應(yīng)體系和條件 PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系20μL,包含2μL PCR buffer(Mg2+plus),3.2μL dNTP (2.5mmol/L),2μL DNA模板,1μL引物(each 3μmol/L),0.4μL Taq酶(2.5U/mL),10.4μL雙蒸水;同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照,即在20μL PCR體系中使用等量雙蒸水代替DNA。

    PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4min,94℃變性30s,68℃退火1min,72℃延伸2min,35個(gè)循環(huán),72℃再延伸10min,4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

    表1 PCR引物序列Table 1 Sequence of PCR primer

    2 結(jié)果與分析

    2.1 DNA濃度對(duì)PCR結(jié)果的影響

    分別選取不同量的DNA(5、10、15、20、25、50ng)為模板,以FCM/RCM為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳結(jié)果見圖1。由圖1可知,當(dāng)DNA含量低于15ng時(shí)無目的條帶出現(xiàn),15ng時(shí)開始出現(xiàn)目的條帶但較弱,加大DNA用量時(shí),目的條帶愈加清晰。當(dāng)DNA用量為50ng時(shí),模板中的雜質(zhì)含量也同時(shí)上升,此時(shí)PCR擴(kuò)增也易受雜質(zhì)干擾出現(xiàn)雜帶,因而選用25ng為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的DNA用量。

    圖1 DNA濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Fig.1 Effect of DNA concentrations on PCR amplification

    2.2 引物濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

    DNA用量為25ng時(shí),設(shè)定引物FCM/RCM的不同濃度(1、2、3、4、5、10、20mmol/L)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,引物濃度為1mmol/L時(shí),無目的條帶擴(kuò)增;增大至2mmol/L和3mmol/L時(shí),目的條帶清晰度較低;當(dāng)引物濃度為4mmol/L時(shí),目的條帶較清晰;大于4mmol/L時(shí),開始有微弱的非特異性雜帶出現(xiàn),且隨著引物濃度的增大,非特異性趨于明顯,綜上所述,選擇4mmol/L作為最終的引物濃度。

    圖2 引物濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Fig.2 Effect of primer concentrations on PCR amplification

    2.3 保質(zhì)期對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

    取不同保質(zhì)期的品牌A牛奶(7、21、45、180d)提取DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳結(jié)果見圖3。由圖3可知,保質(zhì)期7d的A品牌鮮牛奶目的條帶最強(qiáng),保質(zhì)期21d的目的條帶強(qiáng)度次之,保質(zhì)期45d的純牛奶條帶最弱,保質(zhì)期180d的A品牌純牛奶沒有PCR擴(kuò)增。

    圖3 保質(zhì)期對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Fig.3 Effect of shelf lives on PCR amplification

    2.4 不同品牌牛奶的PCR擴(kuò)增結(jié)果

    在優(yōu)化PCR體系后,分別取四種不同品牌的鮮牛奶(A、B、C、D)提取DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增電泳,結(jié)果如圖4所示。由圖4可見,四種品牌的牛奶均出現(xiàn)了目的條帶,且條帶的差異不大,說明不同品牌的鮮牛奶中均含有此種過敏原。

    2.5 牛奶過敏原PCR檢測(cè)方法的特異性

    為考察所建立的PCR檢測(cè)方法的特異性,以A品牌純牛奶DNA模板為陽性對(duì)照,分別取不同品牌的羊奶(頂羊,御寶,陽春)提取DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,A品牌純牛奶(21d)出現(xiàn)了清晰的目的條帶,而不同來源的羊奶未出現(xiàn)相應(yīng)目的條帶,表明引物FCM/RCM具有較好的特異性。

    2.6 A品牌純牛奶和頂羊純羊奶混合物的PCR檢測(cè)

    將A品牌純牛奶(21d)和頂羊羊奶(30d)按不同比例(牛奶∶羊奶=0.5∶1,1∶1,2∶1,3∶1,4∶1,5∶1,10∶1)混合,上述混合物提取DNA,PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示。由圖6可見,目的條帶隨著牛奶比例的提升從無到有,從弱到強(qiáng);在牛奶∶羊奶=3∶1(V/V)時(shí)開始出現(xiàn)微弱的目的條帶;4∶1、5∶1和10∶1時(shí),目的條帶較為清晰。

    圖4 不同品牌牛奶PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR results of different brands milk

    圖5 A品牌純牛奶和不同品牌羊奶PCR結(jié)果Fig.5 PCR results of brand A pure milk and different brands goat milk

    圖6 A品牌純牛奶和頂羊純羊奶混合物PCR結(jié)果Fig.6 PCR results of mixture of brand A pure milk and Dingyang pure goat milk

    為進(jìn)一步確認(rèn)PCR檢測(cè)方法的臨界點(diǎn),在牛奶∶羊奶=3∶1(V/V,下同)附近設(shè)置了更多的混合比例(牛奶∶羊奶=1.5∶1,2∶1,2.2∶1,2.4∶1,2.6∶1,2.8∶1,3∶1),PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖7所示。由圖7可知,在牛奶∶羊奶=2.6∶1(V/V)時(shí),目的條帶開始出現(xiàn)但較弱;小于2.6∶1的比例混合時(shí),沒有目的條帶出現(xiàn),可以初步認(rèn)定在本實(shí)驗(yàn)條件下,牛奶∶羊奶=2.6∶1 (V/V)為檢測(cè)的臨界值。

    圖7 不同比例混合的牛奶和羊奶PCR結(jié)果Fig.7 PCR results of mixture with different ratios of milk and goat milk

    3 討論

    DNA和引物的用量是影響PCR擴(kuò)增的重要因素,只有在適宜的濃度范圍內(nèi)才能得到理想的擴(kuò)增條帶[14-15]。過低的DNA模板量和引物用量使得擴(kuò)增效率低下甚至擴(kuò)增不出對(duì)應(yīng)的目的條帶;DNA過量時(shí)引物會(huì)過早耗盡,使得擴(kuò)增產(chǎn)物與模板DNA之間發(fā)生退火或者擴(kuò)增產(chǎn)物之間發(fā)生退火,導(dǎo)致出現(xiàn)彌散狀背景[15];過高的引物用量傾向于形成非特異性產(chǎn)物,同時(shí)形成大量引物二聚體。所以本實(shí)驗(yàn)考察了模板量和引物用量對(duì)PCR擴(kuò)增的影響,結(jié)果證實(shí)隨著DNA量的增加,目的條帶呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì);在15ng以下幾乎檢測(cè)不到牛奶過敏原的存在;DNA用量為25ng時(shí)可以得到較為清晰、分辨率較高的條帶;在設(shè)定的7個(gè)引物濃度梯度中,最佳引物用量為4mmol/L。

    實(shí)際商品檢測(cè)中,不同處理(加熱、酸堿等)方式及保存方式對(duì)DNA提取和PCR檢驗(yàn)結(jié)果也會(huì)有一定影響[14,16-17]。Gawienowski M C等[16]研究表明,經(jīng)浸泡、濕磨等加工過程能使玉米基因和質(zhì)粒DNA降解,135℃加熱2h后,DNA幾乎完全降解;Kharazmi M等[17]認(rèn)為,浸泡后又經(jīng)過物理破碎處理而做成的豆奶、豆腐和熱加工做成的玉米糊和馬鈴薯,沒有檢測(cè)出大于1.1kb的DNA片段。本實(shí)驗(yàn)提取不同保質(zhì)期的牛奶DNA,同等模板量進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明不同保質(zhì)期的牛奶PCR結(jié)果有一定差異。

    PCR方法的特異性主要體現(xiàn)在特異引物與靶基因的專一、有效的結(jié)合上,而與其他相似的序列無法進(jìn)行結(jié)合[18]。在牛奶和不同品牌羊奶的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中,結(jié)果顯示引物FCM/RCM不會(huì)與羊奶基因組DNA發(fā)生特異性結(jié)合,無目的條帶產(chǎn)生,這說明本方法特異性較好。因此,本方法可用于牛奶過敏原的特異性檢測(cè)。

    與牛奶相比,羊奶中的β-乳球蛋白的含量比牛奶低,且氨基酸排列順序與牛奶不同,較牛奶更易消化,因此羊奶可以解除大部分牛奶過敏癥[19];但是羊奶產(chǎn)量較低,因此有不法商家將牛奶摻雜進(jìn)羊奶銷售,此種混合物難以用肉眼進(jìn)行區(qū)分,所以本文按不同比例將牛奶混合進(jìn)羊奶之中,使用本文建立的PCR方法檢測(cè)羊奶之中的牛奶含量。結(jié)果表明,當(dāng)牛奶∶羊奶比例為2.6∶1(V/V)時(shí),能檢測(cè)出來羊奶之中的牛奶成分,更多這方面的應(yīng)用正在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中。

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    PCR method for the detection of allergen in milk

    XU Qing-jin,DENG Zhi-rui,ZHANG Wen-ju,CHEN Qin*
    (School of Life Sciences,Shanghai University,Shanghai 200444,China)

    Milk is considered to be a kind of important allergen,and β-lactoglobulin is one major component of allergens in milk.A pair of primers was designed based on the gene sequence of β-lactoglobulin in milk and PCR reaction system was optimized for detecting β-lactoglobulin allergen.The results showed that best results could be obtained by combining 25ng template DNA with 4mmol/L primers used for PCR analysis.The established method can not only be successfully applied in detecting β-lactoglobulin allergen in milk from different shelf lives,and resources,but also in detecting the allergen in the mixture at different ratios of cow milk and goat milk.

    β-lactoglobulin;PCR;milk allergen

    TS207.3

    A

    1002-0306(2012)06-0104-04

    2011-05-18 *通訊聯(lián)系人

    許慶金(1984-),男,在讀研究生,研究方向:食品安全檢測(cè)。

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