響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的提取工藝

胡 筱，李春陽，周 濤，*

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇南京210097; 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014）

響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的提取工藝

胡 筱1，李春陽2，周 濤1，*

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇南京210097; 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014）

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的最佳提取工藝，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:乙醇體積分?jǐn)?shù)85.00%、提取溫度66℃、液料比9.2∶1（mL/g），在此條件下藍(lán)莓葉提取物抑菌效果最好，抑菌圈直徑平均值達(dá)18.07mm。

響應(yīng)面法，藍(lán)莓葉，抑菌，提取工藝

藍(lán)莓，又稱越橘，屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.）多年生落葉或常綠灌木［1］。分布于中國、俄羅斯、歐洲、北美、日本、朝鮮等北半球高緯度國家［2］。藍(lán)莓作為一種藥食兩用植物，以葉入藥，性溫、味苦，有利尿、消炎、解毒之功效，并可用于風(fēng)濕、痛風(fēng)的治療。藍(lán)莓葉中含有豐富的黃酮類、原花青素、花色苷類等多種多酚類生理活性成分，還富含多種微量元素［3］。植物多酚能與生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖結(jié)合，并能與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，對微生物具有抑制作用［4］。對于藍(lán)莓的研究，大多局限于對其果實(shí)營養(yǎng)成分、藥用成分的測定，而對藍(lán)莓葉的應(yīng)用和研究較少。目前國內(nèi)外對藍(lán)莓葉的研究主要集中在活性物質(zhì)的提取純化、黑色素的穩(wěn)定性及其生理功能［5－10］方面，對于藍(lán)莓葉提取物抑菌作用的研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法（RSM）［11］優(yōu)化藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的提取工藝，旨在為藍(lán)莓葉資源的利用及天然抑菌劑的開發(fā)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓葉 采自南京市溧水傅家邊農(nóng)業(yè)科技觀光園;大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus） 南京師范大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室;培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;無水乙醇、氫氧化鈉、瓊脂、氯化鈉 均為分析純;牛肉膏、蛋白胨 均為生化試劑。

YXQ－LS－SII型高壓滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;LD5－10型低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;N－1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛郎儀器有限公司;SW－CJ－IF型無菌超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;DHG－9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;CHA－S氣浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱 蘇州江東精密儀器有限公司;722N可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓葉提取物的制備 藍(lán)莓葉經(jīng)60℃干燥后粉碎過篩，稱取藍(lán)莓葉粉末5g，加入提取劑，在一定溫度下冷凝回流，真空抽濾，4000r/min離心8min，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5m L原液（此處原液指1m L提取液中含有1g原材料的提取物，即1g/m L），原液經(jīng)0.2μm微孔除菌膜過濾除菌后，4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌懸液的制備 在無菌條件下，將供試菌種接種到牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，挑取菌落，用無菌生理鹽水稀釋，獲得6～7 lgCFU/m L的菌懸液，備用［12］。

1.2.3 提取物抑菌作用的測定 采用打孔法測定提取液抑菌作用。吸取適宜體積分?jǐn)?shù)的菌懸液0.1m L加入平皿中，倒入溫度冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基約15m L后搖勻;待培養(yǎng)基凝固后，用打孔器在平板上打出三個(gè)直徑為6mm的圓孔，向圓孔中加入50μL提取液，每個(gè)菌種每種提取物做三組平行，另以試樣含同樣體積分?jǐn)?shù)的乙醇為空白對照。平皿放置于37℃下培養(yǎng)24h后，用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑，以抑菌圈直徑大小作為衡量提取液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌活性的指標(biāo)。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 以兩種菌種抑菌圈直徑的平均值為指標(biāo)，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、液料比和提取時(shí)間四個(gè)因素的影響規(guī)律。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定因素水平，采用 Design Expert 7.0軟件的 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［13］，選取影響抑菌物質(zhì)提取率的3個(gè)主要因素:乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和液料比進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化組合，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Factors and coded levels in the Box－Behnken experimental design

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取物抑菌效果的影響 在液料比10∶1（m L/g），溫度60℃，時(shí)間6h的提取條件下，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的提取率也隨之增大。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%以上時(shí)，抑菌效果隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而減弱（見圖1）。這可能是由于一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)的成分增大溶出，干擾因素增大，從而導(dǎo)致抑菌物質(zhì)的提取率下降。

2.1.2 提取溫度對提取物抑菌效果的影響 在液料比10∶1（m L/g），乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，時(shí)間6h的提取條件下，隨著提取溫度的升高，藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的提取率先增后減（見圖2）。在溫度60℃時(shí)，提取物的抑菌活性達(dá)到最高值，繼續(xù)增加提取溫度，抑菌活性反而下降。溫度過高，活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破壞;另一方面也會(huì)造成溶劑的損失和成本費(fèi)用增加。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對抑菌效果的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on antibacterial activity of the extract

圖2 提取溫度對抑菌效果的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on antibacterial activity of the extract

2.1.3 液料比對提取物抑菌效果的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，溫度60℃，時(shí)間6h的提取條件下，隨著液料比的升高，藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的提取率也隨之增大（見圖3）。液料比10∶1（m L/g）時(shí)，藍(lán)莓葉提取物的抑菌活性最強(qiáng)。繼續(xù)增大液料比，抑菌活性變化不大。前期溶劑量大，可以增加物料與溶劑的接觸面積，有效成分浸出更加完全，當(dāng)液料比達(dá)到一定的比例時(shí)，提取劑中抑菌物質(zhì)的溶解度基本達(dá)到飽和，此時(shí)再增大液料比會(huì)造成溶劑和能源的浪費(fèi)，并使進(jìn)一步的濃縮時(shí)消耗更多的能量和時(shí)間。

圖3 液料比對抑菌效果的影響Fig.3 Effect ofmaterial－to－liquid ratio on antibacterial activity of the extract

2.1.4 提取時(shí)間對提取物抑菌效果的影響 在液料比10∶1（m L/g），乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，溫度60℃的提取條件下，隨著提取時(shí)間的增加，藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的提取率也隨著增大（見圖4）。但當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到6h以上時(shí)，抑菌效果隨提取時(shí)間的增加而減弱。表明提取時(shí)間在1～6h時(shí)，物料與溶劑接觸越來越充分，體積分?jǐn)?shù)差也較大，擴(kuò)散速度快，加速了有效抑菌成分的浸出［14］。隨著時(shí)間延長，增加了非抑菌成分的浸出，同時(shí)抑菌成分可能也受到了破壞。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

圖4 提取時(shí)間對抑菌效果的影響Fig.4 Effect of extraction time on antibacterial activity of the extract

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果與分析 按表1因素與水平設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results of the Box－Benhnken test

2.2.2 回歸模型的建立及其顯著性檢驗(yàn) 利用Design－Expert 7.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、提取溫度（X2）、液料比（X3）的二次多項(xiàng)回歸模型:

對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3，回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表4。

從表3可見，對藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)提取所建立的回歸模型差異極顯著（P＜0.0001），說明該回歸方程因變量和全體自變量的相關(guān)關(guān)系是顯著的，即這種實(shí)驗(yàn)方法是可靠的。失擬項(xiàng)P＞0.05，差異不顯著，說明可以用該回歸方程對不同提取條件下的抑菌物質(zhì)的提取效果進(jìn)行檢測。復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9772，說明該模型能解釋97.72%響應(yīng)者的變化，即該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合良好，實(shí)驗(yàn)誤差小。校正決定系數(shù)R2Adj=0.9478，說明該回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。另外，該模型的變異系數(shù)為1.50%，數(shù)值較低，說明該實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好［15］，可靠性強(qiáng)。該模型的RSN（信噪比）為17.568，遠(yuǎn)大于4，說明用此模型可以得到足夠強(qiáng)的響應(yīng)信號。由此可知，回歸方程的擬合度和可信度均很高，能夠很好地對藍(lán)莓葉中抑菌物質(zhì)的提取進(jìn)行預(yù)測。

由表4可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的交互作用、提取溫度的二次項(xiàng)和液料比的二次項(xiàng)對抑菌效果有極顯著影響（P＜0.01）;乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和液料比的一次項(xiàng)以及提取溫度和液料比的交互作用對抑菌效果有顯著影響;乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的交互作用、乙醇體積分?jǐn)?shù)的二次項(xiàng)影響不顯著。表明乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和液料比對藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的提取影響顯著，并且乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度、提取溫度和液料比之間存在交互作用。由3個(gè)因素的F值大小可知，對藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的提取效果影響的顯著性順序依次為液料比＞提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 根據(jù)回歸模型作出兩因素交互作用的響應(yīng)曲面及其等高線圖，結(jié)果見圖5～圖7。如果一個(gè)響應(yīng)曲面坡度非常陡峭，表示響應(yīng)值對于各實(shí)驗(yàn)表件改變很敏感［16］。

圖5顯示在液料比為10∶1條件下，提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)提取的影響。提取溫度對抑菌物質(zhì)提取的影響顯著，曲面較陡，乙醇體積分?jǐn)?shù)對抑菌物質(zhì)提取的影響不太顯著，曲面相對較緩和。圖6顯示在提取溫度為60℃條件下，液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)提取的影響。液料比對抑菌物質(zhì)提取的影響顯著，曲面較陡，乙醇體積分?jǐn)?shù)對抑菌物質(zhì)的影響不太顯著，曲面相對較緩和。圖7顯示在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%條件下，液料比和提取溫度對藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)提取的影響。液料比和提取溫度對抑菌物質(zhì)提取的影響均顯著，曲面都較陡。

表4 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Test results of significance for regression coefficient

圖5 提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對抑菌效果影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface graph indicating the effects of extraction temperature，ethanol concentration and their interactions on antibacterial activity of extract

圖6 液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對抑菌效果影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface graph indicating the effects of material－to－liquid ratio，ethanol concentration and their interactions on antibacterial activity of extract

2.2.4 回歸方程及模型驗(yàn)證 對回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，整理得如下:

由式（1）～式（3）聯(lián)立解方程組，換算成實(shí)驗(yàn)條件得到乙醇體積分?jǐn)?shù)X1=85.00%，提取溫度X2= 65.83℃，液料比X3=9.18∶1。在此條件下，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌圈直徑可達(dá)18.13mm?？紤]實(shí)際情況將最佳工藝條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)85.00%，提取溫度66℃，液料比9.2∶1，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，實(shí)際測得的抑菌圈直徑為18.07mm，與理論預(yù)測值相比，其相對誤差約為1%，說明該模型準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

圖7 液料比和提取溫度交互作用對抑菌效果影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface graph indicating the effects of material－to－liquid ratio，extraction temperature and their interactions on antibacterial activity of extract

3 結(jié)論

藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的最佳提取工藝參數(shù)為:乙醇體積分?jǐn)?shù)85.00%，提取溫度66℃，液料比9.2∶1，提取時(shí)間6h。此時(shí)，藍(lán)莓葉中抑菌物質(zhì)提取效果最佳，抑菌圈直徑可達(dá)18.07mm，與模型預(yù)測值接近。本研究為藍(lán)莓葉資源的綜合利用和天然抑菌劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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Optim ization of extraction technology of antim icrobial substances from blueberry leaves by response surface analysis

HU Xiao1，LIChun－yang2，ZHOU Tao1，*

（1.Ginling College，Nanjing Normal University，Nanjing 210097，China; 2.Institute of Agro－food Science and Technology，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China）

In order to ob tain op timum cond itions for extrac tion of antibac terial substance from b lueberry leaves，on the basis of sing le factor investigations，response surface methodology（RSM）was used to study effec ts of ethanol concentration，extrac tion tim e and solid－liquid ratio on the extraction rate of antim ic robial substances.Results showed that the op timum cond itions were as follows:ethanol concentration 85.00%，extraction temperature 66℃and liquid－to－material ratio 9.2∶1（m L/g）.Under the op tim ized cond itions，the maximum d iameter of inhibition zone was 18.07mm.

response surface m ethodology;b lueberry leaves;antibac terial;extraction p rocess

TS201.3

A

1002－0306（2012）06－0309－05

2011－06－15 *通訊聯(lián)系人

胡筱（1988－），女，碩士研究生，研究方向:食品安全。

2009年江蘇省國際科技合作項(xiàng)目（BZ2009025）。