大孔樹(shù)脂純化寒富蘋(píng)果渣多酚工藝優(yōu)化

呂春茂，宋雨涵，孟憲軍，趙明慧，王 博

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866）

大孔樹(shù)脂純化寒富蘋(píng)果渣多酚工藝優(yōu)化

呂春茂，宋雨涵*，孟憲軍，趙明慧，王 博

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866）

通過(guò)研究10種大孔樹(shù)脂對(duì)寒富蘋(píng)果渣多酚的靜態(tài)吸附及解吸性能，篩選出一種最佳的大孔樹(shù)脂，并利用這種樹(shù)脂對(duì)寒富蘋(píng)果多酚的純化工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明:HPD－826型樹(shù)脂有較好的吸附和解吸性能，經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定其純化蘋(píng)果多酚的最佳動(dòng)態(tài)吸附條件:蘋(píng)果多酚提取液pH為5，濃度在0.5～0.8mg/mL之間，上樣速度1mL/min;最佳洗脫條件:洗脫液為60%的乙醇溶液，解吸溫度20℃，洗脫流速0.5mL/min。在此條件下，純化樣品的多酚純度為52.26%。關(guān)鍵詞:寒富蘋(píng)果，多酚，大孔樹(shù)脂，純化

蘋(píng)果 （Malus pum ila Mill），屬于薔薇科（Rosaceae）蘋(píng)果屬（Malus）落葉喬木。在世界范圍均有種植，栽培歷史悠久。蘋(píng)果果實(shí)具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分與食療、輔助治療等功能［1－2］。寒富蘋(píng)果為沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)李懷玉教授采用東光和富士雜交選育出的擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗寒優(yōu)質(zhì)蘋(píng)果品種［3］。蘋(píng)果渣是蘋(píng)果加工中的副產(chǎn)物，含有豐富的生物活性物質(zhì)［4］，它的綜合利用不僅能提高企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，還能避免大量的蘋(píng)果廢渣對(duì)環(huán)境造成污染。蘋(píng)果多酚具有很高的藥理、生理價(jià)值，因而廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、日用化工等領(lǐng)域，發(fā)揮著不可替代的作用［5－6］。目前蘋(píng)果多酚的提取主要采用有機(jī)溶劑提取法、超臨界流體萃取、超聲波輔助萃取法、微波輔助提取法等［7］。本研究利用有機(jī)溶劑提取法（超聲波輔助提取），但得到的蘋(píng)果多酚粗提物存在較多的雜質(zhì)，因而需要進(jìn)一步純化。蘋(píng)果多酚的分離純化主要采用大孔樹(shù)脂的柱層析技術(shù)［7］。大孔樹(shù)脂是一種多孔性高分子吸附分離材料，比表面積很大，具有選擇性強(qiáng)、吸附容量大、吸附速度快、解吸容易、成本低等優(yōu)點(diǎn)［8］。本研究以篩選出的具有較佳吸附和解吸性能的樹(shù)脂為介質(zhì)，找出其最佳的吸附及解吸條件，并對(duì)寒富蘋(píng)果渣中多酚粗提物進(jìn)行初步純化，以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供有價(jià)值的參考意見(jiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

寒富蘋(píng)果 采于沈陽(yáng)市深井子金德勝果園; HPD－100、HPD－600、HPD－700、HPD－826、AB－8、S－8、WD－6、ADS－17、D101、D301 10種大孔樹(shù)脂滄州寶恩吸附材料科技有限公司;沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、氫氧化鈉 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水乙醇 天津市百世化工有限公司;鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水碳酸鈉、鹽酸 天津東華試劑廠;所有試劑 均為分析純。

JY92－Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;TU－1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;DHG－9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SHB－ⅢA循環(huán)水式真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;HH－6恒溫水浴鍋、SHA－C恒溫水浴振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司;HL－25恒流泵 上海青浦滬西儀器廠; LG－5/12真空冷凍干燥機(jī) 北京廣開(kāi)源科學(xué)器材;榨汁機(jī)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘋(píng)果多酚粗提物的制備 寒富蘋(píng)果→蘋(píng)果渣→乙醇溶液浸提（超聲波輔助提?。闉V→真空濃縮→真空干燥→蘋(píng)果多酚粗提物

1.2.2 蘋(píng)果多酚含量測(cè)定方法 采用福林（Folin－Ciocalteus）法，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定蘋(píng)果多酚提取液中多酚的含量。

提取液多酚物質(zhì)含量的測(cè)定:從一定體積的提取液中吸取100μL置于10m L容量瓶中，加入福林試劑2.0m L，充分振蕩后靜置3～4m in，再加入10% Na2CO3溶液2.0m L，定容，搖勻置于25℃恒溫水浴中反應(yīng)2h，以試劑空白為對(duì)照，765nm下測(cè)定吸光度A765。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得100μL待測(cè)液中多酚物質(zhì)的含量，進(jìn)一步算出提取液中多酚物質(zhì)的含量［9－10］。

1.2.3 樹(shù)脂的預(yù)處理及再生 各種大孔吸附樹(shù)脂用無(wú)水乙醇在室溫下密封浸泡8h，使其充分溶脹;然后用無(wú)水乙醇沖洗至無(wú)白色渾濁，蒸餾水洗至中性;再用5%的鹽酸溶液浸泡8h，蒸餾水沖洗至中性;最后用5%的NaOH溶液浸泡8h，蒸餾水沖洗至中性，備用。

樹(shù)脂每次處理過(guò)多酚后需再生，先用無(wú)水乙醇浸泡8h，用蒸餾水洗至中性后再按預(yù)處理方法用5%鹽酸溶液和5%NaOH溶液處理，備用［11］。

1.2.4 靜態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取用濾紙吸干表面水分的經(jīng)過(guò)預(yù)處理的樹(shù)脂1g（精確到0.0001g），置于250m L三角瓶中，加入已知濃度的蘋(píng)果多酚粗提液100m L，避光密封，置于恒溫水浴振蕩器中，25℃，120 r/min振蕩吸附使之達(dá)到吸附平衡。濾出樹(shù)脂，用蒸餾水洗去表面殘留多酚溶液后用濾紙吸干表面水分備用，F(xiàn)C法測(cè)定容液中剩余多酚濃度，根據(jù)以下公式計(jì)算樹(shù)脂吸附率:

式中:Q為吸附量，mg/g;C0為粗提液中總多酚的起始濃度，mg/m L;Ce為吸附平衡時(shí)溶液中的總多酚濃度，mg/m L;VA為吸附液體積，m L;W為樹(shù)脂質(zhì)量（濕重），g;A為吸附率，%。

量取一定濃度的乙醇溶液100m L于25℃下振蕩洗脫吸附了蘋(píng)果多酚的樹(shù)脂2h，F(xiàn)C法測(cè)定解吸液中總多酚濃度，計(jì)算洗脫率，公式如下:

洗脫率D（%）=CDVD/［（C0－Ce）×VA］×100%

式中:D為洗脫率，%;CD為洗脫液中總多酚濃度，mg/m L;VD為洗脫液體積，m L［12］。

以吸附量、吸附率、洗脫率這三個(gè)指標(biāo)篩選出一種合適的樹(shù)脂，并用這種樹(shù)脂進(jìn)行后續(xù)的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.5 動(dòng)態(tài)吸附與洗脫實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確量取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的樹(shù)脂10m L，濕法裝入1.6×60cm的層析柱中，用蒸餾水平衡后以一定流速上樣并收集流出液，每10m L為一管，當(dāng)流出液中多酚濃度達(dá)到上樣液多酚濃度的10%時(shí)，即出現(xiàn)漏點(diǎn)，停止進(jìn)樣。根據(jù)流出液的總體積、吸附前以及吸附后粗提液中的多酚濃度計(jì)算動(dòng)態(tài)吸附量。

吸附飽和后，用一定量蒸餾水洗去樹(shù)脂表面殘留的蘋(píng)果多酚溶液及可溶性多糖等雜質(zhì)后，以一定的流速用適當(dāng)濃度的乙醇溶液洗脫，每10m L為一管分段收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中多酚物質(zhì)的含量，并繪制洗脫曲線［13－14］。合并多酚含量較高的洗脫液，制成蘋(píng)果多酚樣品粉末，計(jì)算回收率及樣品多酚純度，公式如下:

回收率R（%）=C2V2/C0V1×100%

式中:R為回收率，%;C0為粗提液中總多酚的起始濃度，mg/m L;V1為上樣液的總體積，m L;C2為洗脫液中多酚濃度，mg/m L;V2為洗脫液體積，m L。

純度P（%）=C2V2/M×100%

式中:P為樣品中多酚純度，%;M為多酚樣品重量（干重），mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)

2.1.1 大孔吸附樹(shù)脂的篩選 選擇10種不同型號(hào)的大孔吸附樹(shù)脂，通過(guò)靜態(tài)實(shí)驗(yàn)考察其對(duì)蘋(píng)果多酚的吸附及解吸性能，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 10種大孔樹(shù)脂的吸附及解吸性能Fig.1 Adsorption and desorption properties of10 kinds of resins

通過(guò)圖1可以看出，D301、S－8、HPD－100和HPD－826型樹(shù)脂有較強(qiáng)的吸附能力，AB－8、HPD－600、HPD－700型樹(shù)脂的吸附率也都超過(guò)了35%，D301、S－8、HPD－100、HPD－826型樹(shù)脂和AB－8、HPD－600、HPD－700型樹(shù)脂之間的吸附率差異顯著（p＜0.05）。但D301和S－8型樹(shù)脂的解吸性能較差，說(shuō)明大部分被吸附的多酚物質(zhì)無(wú)法從樹(shù)脂中分離出來(lái)，因而達(dá)不到分離純化的目的。而HPD－700、HPD－826、ADS－17、HPD－600、HPD－100、WD－6型樹(shù)脂的解吸性能則較好，解吸率較高，這六種樹(shù)脂的解吸率差異不顯著（p＞0.05）。綜合分析，HPD－826型樹(shù)脂不僅有較好的吸附能力（吸附率50.50%），解吸性能也很強(qiáng)（解吸率84.13%），因此本實(shí)驗(yàn)選用HPD－826型樹(shù)脂作為分離純化寒富蘋(píng)果多酚的材料。

2.1.2 HPD－826型樹(shù)脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 進(jìn)行靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)時(shí)，定時(shí)從上清液中取樣，測(cè)定多酚含量，繪制靜態(tài)吸附曲線。吸附速度是樹(shù)脂吸附性能的重要參考指標(biāo)［15］。由圖2可知，在吸附的初始階段，HPD－826型樹(shù)脂吸附蘋(píng)果多酚的速率非?？欤?h時(shí)樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附量就達(dá)到了吸附總量的71.45%，2h時(shí)達(dá)到了87.20%，說(shuō)明HPD－826型樹(shù)脂對(duì)蘋(píng)果多酚的選擇性較強(qiáng)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)吸附速率急劇下降，吸附6h時(shí)吸附量為總吸附量的98.56%。隨后樹(shù)脂的吸附量緩慢增加，12h時(shí)基本趨于吸附飽和狀態(tài)。

圖2 HPD－826型樹(shù)脂的靜態(tài)吸附曲線Fig.2 Static adsorption curve of HPD－826 resin

2.1.3 提取液pH對(duì)吸附量的影響 從圖3中可以看出，溶液的pH過(guò)高或過(guò)低時(shí)，樹(shù)脂的吸附量都相對(duì)較低，當(dāng)溶液的pH為5時(shí)，樹(shù)脂對(duì)蘋(píng)果多酚的吸附量最高，為7.57mg/g。通常情況下，酸性物質(zhì)在適當(dāng)?shù)乃嵝匀芤褐斜晃降妮^好，堿性物質(zhì)在適當(dāng)?shù)膲A性溶液中可被充分吸附，中性物質(zhì)則在中性條件下被吸附的較好［16］。蘋(píng)果多酚具有多酚結(jié)構(gòu)，也包含一些酚酸類(lèi)物質(zhì)，如綠原酸等，其提取液呈酸性［17］，因此弱酸性溶液有利于多酚物質(zhì)的吸附，所以調(diào)整溶液的pH為5可提高樹(shù)脂的飽和吸附量。

圖3 pH對(duì)吸附量的影響Fig.3 Effect of pH value on adsorption ratio

2.1.4 提取液濃度對(duì)吸附量的影響 由圖4可知，當(dāng)溶液中多酚物質(zhì)濃度較低時(shí)，隨著溶液濃度的增大，吸附量也隨之增大。當(dāng)粗提液中多酚濃度增加到0.7613mg/m L時(shí)，吸附量最大，達(dá)到了16.53mg/g。但如果繼續(xù)增大粗提液的濃度，溶液中不僅會(huì)出現(xiàn)絮凝和沉淀，吸附量也呈下降的趨勢(shì)。這可能是由于粗提液中多酚濃度較低時(shí)，濃度的增大可以加強(qiáng)多酚分子與樹(shù)脂的接觸，加速多酚分子進(jìn)入樹(shù)脂內(nèi)部并迅速擴(kuò)散。而當(dāng)粗提液濃度增大到一定程度后，樹(shù)脂表面接觸的多酚分子過(guò)多，互相有一定的阻礙作用，影響多酚分子在樹(shù)脂內(nèi)部的擴(kuò)散，導(dǎo)致樹(shù)脂吸附量下降。同時(shí)，濃度增加，粗提液中能與多酚競(jìng)爭(zhēng)吸附的雜質(zhì)也會(huì)增加［18］。因此，多酚溶液的濃度應(yīng)控制在0.5～0.8mg/m L之間。

圖4 溶液濃度對(duì)吸附量的影響Fig.4 Effect of solutiong concentration on adsorption ratio

2.1.5 解吸溫度對(duì)解吸率的影響 吸附飽和的樹(shù)脂在不同的溫度下進(jìn)行解吸實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示，隨著解吸溫度的升高，樹(shù)脂的解吸率呈下降的趨勢(shì)。在20℃時(shí)，解吸效果最好，解吸率為84.26%，所以將溫度控制在20℃左右將有利于樹(shù)脂的解吸。

圖5 溫度對(duì)解吸率的影響Fig.5 Effect of temperature on desorption ratio

2.1.6 解吸劑濃度對(duì)解吸率的影響 本實(shí)驗(yàn)選擇安全無(wú)毒的乙醇作為解吸劑。由圖6可知，在乙醇濃度較低的條件下，增加乙醇溶液濃度，解吸率也隨之增加，這可能是因?yàn)橐掖紳舛容^低時(shí)無(wú)法有效地破壞樹(shù)脂與多酚之間形成的氫鍵，以致解吸率較低［19］。當(dāng)乙醇濃度增加到60%時(shí)，解吸率為85.24%，繼續(xù)增加乙醇濃度解吸率雖稍有下降，但也相對(duì)較高?？紤]到高濃度乙醇易揮發(fā)且增加生產(chǎn)成本，選擇60%的乙醇作為解吸劑較為合適。

圖6 乙醇濃度對(duì)解吸率的影響Fig.6 Effect of the concentration of ethanol on desorption ratio

2.2 動(dòng)態(tài)吸附與洗脫實(shí)驗(yàn)

2.2.1 上樣速率對(duì)動(dòng)態(tài)吸附量的影響 上樣速率主要是影響溶質(zhì)向樹(shù)脂表面的擴(kuò)散，流速不同則樹(shù)脂達(dá)到吸附飽和時(shí)的吸附量也不同。上樣速度慢，雖有利于樹(shù)脂對(duì)多酚物質(zhì)的吸附，可是會(huì)延長(zhǎng)樹(shù)脂達(dá)到吸附飽和的時(shí)間，降低樹(shù)脂吸附的效率。但當(dāng)上樣速率過(guò)大時(shí)，溶液中的多酚物質(zhì)還未擴(kuò)散到樹(shù)脂的內(nèi)表面，就被沖出柱子，從而造成樹(shù)脂吸附率的下降［20］。從圖7中可以看出，隨著上樣速率的增加，樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附量反而降低，上樣速率為2.5m L/min時(shí)，樹(shù)脂的吸附量?jī)H為2.30mg/m L。上樣速率為0.5m L/min時(shí)，吸附量最高，為6.06mg/m L。上樣速率為1.0m L/m in時(shí)吸附量略低于0.5m L/m in上樣的吸附量，為5.93mg/m L，相差不大。考慮到樹(shù)脂的吸附量和工作效率的問(wèn)題，控制上樣速率為1.0m L/min較好。

圖7 上樣速率對(duì)吸附量的影響Fig.7 Effect of feeding rate on adsorption capacity

2.2.2 洗脫速率對(duì)洗脫效果的影響 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)確定的吸附流速，選擇0.5、1.0m L/m in兩個(gè)洗脫速率來(lái)考察動(dòng)態(tài)洗脫的效果［21］。從圖8可以看出，少量的洗脫劑就可將吸附在樹(shù)脂上的蘋(píng)果多酚洗脫下來(lái)，但不同的洗脫速率對(duì)洗脫效果有較大的影響。以0.5m L/m in的速率進(jìn)行洗脫時(shí)，峰形較集中，洗脫率可達(dá)到89.24%。其中2～4BV的洗脫液中多酚物質(zhì)含量較高，合并多酚含量較高的洗脫液，經(jīng)計(jì)算回收率可達(dá)到65.72%。合并的洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后真空冷凍干燥得蘋(píng)果多酚樣品，純度為52.26%。以1.0m L/m in的速率洗脫則洗脫帶略寬，稍有拖尾現(xiàn)象，洗脫率只有79.59%，洗脫不完全。因?yàn)檩^低的速度能增加洗脫劑在樹(shù)脂柱中停留的時(shí)間，有利于洗脫劑向樹(shù)脂內(nèi)部擴(kuò)散，從而將蘋(píng)果多酚從樹(shù)脂中洗脫出來(lái)。因此選擇0.5m L/min的洗脫流速。

圖8 動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.8 Dynamic elution curve

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)得出，HPD－826型樹(shù)脂具有良好的吸附和解吸性能。并且由靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)可以看出HPD－826型樹(shù)脂對(duì)多酚的吸附速度較快，是初步分離純化寒富蘋(píng)果多酚的優(yōu)良材料。

3.2 當(dāng)多酚溶液濃度為0.5～0.8mg/m L，pH為5時(shí)，以1.0m L/m in的流速上樣，HPD－826型樹(shù)脂對(duì)寒富蘋(píng)果多酚的吸附量較高。

3.3 在20℃以60%的乙醇作為洗脫劑，洗脫流速為0.5m L/m in時(shí)，洗脫效果較好，洗脫率為89.24%。洗脫液經(jīng)濃縮干燥，多酚純度可達(dá)52.26%。

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Optim ization of purification process of Hanfu apple pomace polyphenols w ith macroporous absorbent resin

LV Chun－mao，SONG Yu－h(huán)an*，MENG Xian－jun，ZHAO M ing－h(huán)ui，WANG Bo

（College of Food Science，Shenyang Agriculture University，Shenyang 110866，China）

Accrod ing to the p roperties of static adsorp tion and desorp tion of 10 kinds ofmacroporous absorbent resin for polyphenols in Hanfu app le pomace，the best one was sc reened to op tim ize the purified technology of app le polyphenols from Hanfu app le polyphenols.Results indicated that:mac roporous resin HPD－826 had the best p roperties of adsorp tion and desorp tion.The op timal adsorp tion conditions of app le polyphenols purification were determ ined as follows:app le polyphenols solution pH 5，solution concentration of app le polyphenols 0.5～0.8mg/m L，feed ing speed 1m L/m in.And the op timal desorp tion cond itions were ethanol concentration 60%，desorp tion temperature 20℃，elution speed 0.5m L/m in.Under these cond itions，the content of app le polyphenols in purified p roductwas 52.26%.

Hanfu app le;polyphenols;macroporous absorbent resin;purification

TS255.1

B

1002－0306（2012）06－0300－05

2011－06－21 *通訊聯(lián)系人

呂春茂（1970－），男，博士，副教授，主要從事食品生物技術(shù)及其在果品深加工中應(yīng)用的研究。

沈陽(yáng)市大型儀器共享項(xiàng)目（4130199－1102－01083909001）。