兩種靈芝多糖對小鼠免疫功能增強(qiáng)作用研

黃生權(quán)，潘華新，周 聯(lián)，*

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)免疫研究室，廣東廣州510405）

兩種靈芝多糖對小鼠免疫功能增強(qiáng)作用研

黃生權(quán)1，潘華新2，周 聯(lián)2，*

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)免疫研究室，廣東廣州510405）

研究兩種不同工藝提取的靈芝多糖－超聲提取多糖（UCP）和堿提多糖（ACP）對小鼠免疫功能的增強(qiáng)作用。實驗小鼠分別按低、中、高劑量胃飼兩種靈芝多糖提取物，測試其對小鼠免疫功能的影響（小鼠碳廓清實驗、遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)、血清溶血素測定、NK細(xì)胞活性實驗）。結(jié)果表明，各劑量組的UCP和ACP血清溶血素含量，ACP各劑量和UCP高劑量組的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH），高劑量組的ACP小鼠碳廓清能力，高劑量組UCP和ACP中、高劑量的小鼠NK細(xì)胞活性，UCP低劑量組的小鼠胸腺指數(shù)，與對照組比較均有顯著性差異（p＜0.05）。說明兩種靈芝多糖均能提高小鼠的免疫功能，ACP的作用優(yōu)于UCP，且靈芝多糖對小鼠免疫功能的增強(qiáng)作用并不是劑量越大越好，而是存在最適劑量。

靈芝多糖，免疫活性，遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)，碳廓清實驗，血清溶血素測定，NK細(xì)胞活性

靈芝多糖（Ganoderma Lucidum polysaccharides） 是靈芝Ganoderma Lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst的主要活性成分，以往研究表明，它具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用[1-5]。然而，不同提取工藝提取的靈芝多糖，其免疫活性是否不同，尚未見報道。本文通過觀察兩種靈芝多糖提取物對免疫功能低下小鼠的特異性細(xì)胞免疫、體液免疫和非特異性免疫功能的影響，比較靈芝多糖不同提取工藝對其免疫活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

兩種靈芝多糖提取物 超聲提取多糖（UCP）和堿提多糖（ACP）為分別按超聲波和稀堿兩種不同工藝所得粗提取物，由無限極（中國）有限公司提供，UCP多糖含量為40.80%，ACP多糖含量為55.13%，UCP、ACP按多糖含量分別配成高（200mg/（kg·d））、中（100mg/（kg·d））、低（50mg/（kg·d））三個劑量；茯苓多糖口服液 10mL/支，16mg/mL，由湖南補(bǔ)天藥業(yè)有限公司出品，批號：20070901；注射用環(huán)磷酰胺 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；地塞米松磷酸鈉注射液 5mg/mL，廣東三才醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；二硝基氟苯溶液（2，4－Dinitrofluorobenzene，DNFB） 美國Sigma公司；綿羊紅細(xì)胞（SRBC） 新鮮綿羊全血購自廣州石馬實驗場；豚鼠補(bǔ)體 取10只健康的SPF級豚鼠血清制備而成；YAC－1細(xì)胞 購自中山大學(xué)細(xì)胞中心；熒光染料CFSE 美國Invitrogen公司；碘化丙錠（Propidium Iodide，PI）溶液 美國Sigma公司；SPF級NIH系小鼠 6～8周齡，體重18～22g，雄性，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2008－0002，粵監(jiān)證字2008A021，合格證號：0051028，按體重分層隨機(jī)分為9組：正常對照組、模型對照組、茯苓多糖口服液組、UCP低劑量組、UCP中劑量組、UCP高劑量組、ACP低劑量組、ACP中劑量組、ACP高劑量組，每組10～11只動物。

MCO175型二氧化碳培養(yǎng)箱 日本SANYO公司；TGL－5型臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀 美國BD公司；GS－15R型高速冷凍離心機(jī) 美國BEKMAN公司；多功能酶標(biāo)儀Spectra FLUOR plus 瑞典TECAN公司。

1.2 實驗方法

參照文獻(xiàn)[6－8]的方法進(jìn)行。每日給藥1次，連續(xù)30～32d；對照組給予等體積蒸餾水。

1.2.1 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH） 實驗第25d，在小鼠右側(cè)背中部涂擦脫毛劑脫毛。實驗第26d，在脫毛部位滴涂5%DNFB溶液致敏。實驗第27d，腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/kg造模。實驗第30d，以1%DNFB溶液20μL滴涂小鼠左耳殼（兩面）作為攻擊；右耳滴涂丙酮液20μL作為對照。實驗第31d，稱體重，處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8mm的耳片，立即稱重。以左右耳片重量之差為耳廓腫脹度，反映遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的強(qiáng)度。

1.2.2 血清溶血素的測定實驗 實驗第26d，除正常組外，腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg造模，正常對照組注射等體積生理鹽水。實驗第27d，各組小鼠腹腔注射5%SRBC 0.25mL/10g進(jìn)行致敏。實驗第31d，稱取小鼠體重后摘眼球放血，取全血20μL，加入盛有2mL生理鹽水的試管中搖勻，離心。取上清液50μL，加入盛有2.5%SRBC、1∶20豚鼠補(bǔ)體各250μL的試管中，混勻，為待測樣品；以生理鹽水為空白樣。各樣品管置37℃水浴30min，然后置冰水中10min使反應(yīng)終止。之后，離心取上清250μL，用酶標(biāo)儀在540nm波長處測定待測樣品光密度（OD）值。同時，取小鼠胸腺、脾臟稱重，以每10g小鼠的脾臟和胸腺濕重（mg）作為脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

1.2.3 小鼠碳廓清實驗 實驗第27、29d腹腔注射地塞米松50mg/kg造成免疫功能低下模型，正常對照組腹腔注射等體積生理鹽水。實驗第31d，各組小鼠尾靜脈注射1∶5稀釋墨汁0.1mL/10g。分別于注射后2、20min在眶后靜脈叢取血20μL，放入盛有2mL 0.1% Na2CO3溶液的試管中，搖勻。取血完畢后，脫頸椎處死小鼠，取其肝臟和脾臟立即稱重。取所得Na2CO3溶液0.25mL，加入酶標(biāo)板中，在酶標(biāo)儀595nm波長下測量其OD。按公式（1）計算廓清指數(shù)K，公式（2）計算校正廓清指數(shù)α，以校正廓清指數(shù)α表示碳廓清能力。OD1、OD2分別指注射后2min（t1）和20min（t2）的光密度值。

1.2.4 NK細(xì)胞活性測定 實驗第29、31d腹腔注射地塞米松50mg/kg造模。實驗第33d，處死小鼠，取其脾臟，常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液，用消毒超純水溶解紅細(xì)胞，以RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106個/mL。將傳代1d生長的YAC－1細(xì)胞，用PBS調(diào)細(xì)胞濃度至2× 106個/mL，加入終濃度為1μmol/L的熒光染料CFSE，混勻后染色10min，離心棄上清液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1× 105個/mL，取效應(yīng)細(xì)胞（脾細(xì)胞，其中含NK細(xì)胞）及靶細(xì)胞（YAC－1細(xì)胞）各100μL，加入96孔U底板內(nèi)，離心5min后，37℃孵育2h左右，收集細(xì)胞至5mL離心管中，加1mL PBS，離心10min。棄上清液后，用400μL PBS重懸細(xì)胞，加20μL PI溶液，染色后上流式細(xì)胞儀分析。以CFSE和PI雙陽性細(xì)胞為死亡的靶細(xì)胞，按公式（3）計算NK細(xì)胞活性，其中自然死亡率為未加入效應(yīng)細(xì)胞的YAC－1細(xì)胞死亡率，實驗組死亡率為加效應(yīng)細(xì)胞的YAC－1細(xì)胞死亡率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的主要化學(xué)成分分析

表1 兩種靈芝多糖粗品的主要化學(xué)成分分析Table 1 Analysis of main chemical components of two Ganoderma lucidum crude polysaccharides

從表1可以看出，兩種不同工藝提取的靈芝多糖粗品中，ACP中的多糖含量要高于UCP，但折算成干基則兩者比較接近（ACP為69.65%，UCP為64.38%）。蛋白質(zhì)含量則ACP低于UCP，其他成分無明顯差異。

2.2 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）的測定

與正常對照組比較，模型對照組的耳腫脹度顯著下降（p＜0.05），表明免疫低下造模成功。與模型對照組比較，UCP高劑量組和ACP低、中、高劑量組的耳腫脹度顯著升高（p＜0.05），提示兩種供試品對免疫功能低下小鼠T細(xì)胞免疫功能具有提高作用。供試品之間比較，ACP中劑量組的耳腫脹度顯著高于UCP中劑量組（p＜0.05），見表2。

表2 UCP、ACP對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響（±s）Table 2 Effect of UCP and ACP on DTH in mice（±s）

表2 UCP、ACP對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響（±s）Table 2 Effect of UCP and ACP on DTH in mice（±s）

注：①、②、⑤表示分別與（1）、（2）、（5）組比較，p＜0.05。

組別 數(shù)量（只）劑量[mg/（kg·d）]耳腫脹度（mg）正常對照 10 等體積蒸餾水 14.42±2.84模型對照 10 等體積蒸餾水 6.75±2.96①茯苓多糖口服液 10 80 10.77±4.04②UCP低劑量 10 50 8.80±3.38 UCP中劑量 11 100 7.75±4.71 UCP高劑量 11 200 10.73±4.48②ACP低劑量 10 50 12.22±5.77②ACP中劑量 10 100 14.49±4.77②⑤ACP高劑量 11 200 12.12±6.01②

2.3 血清溶血素及胸腺、脾臟指數(shù)的測定

與正常對照組比較，模型對照組的溶血素生成量、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著下降（p＜0.05），表明免疫功能低下造模成功。與模型對照組比較，各供試品組的溶血素生成量均顯著提高（p＜0.05）。UCP、ACP相同劑量之間比較，ACP低劑量組的溶血素生成量明顯高于UCP低劑量組（p＜0.05），ACP高劑量組的溶血素生成量明顯高于UCP高劑量組（p＜0.05），表明ACP低、高劑量的作用優(yōu)于UCP低、高劑量。

與模型對照組比較，UCP低劑量組的胸腺指數(shù)明顯升高（p＜0.05），表明UCP低劑量具有增加免疫功能低下小鼠胸腺重量的作用。各供試品的脾臟指數(shù)與模型對照組比較無顯著性變化，但其指數(shù)有增加的趨勢。UCP、ACP相同劑量之間脾臟、胸腺指數(shù)比較，未見顯著性差異（見表3）。

2.4 小鼠碳廓清實驗

表3 UCP、ACP對小鼠血清溶血素生成及脾臟、胸腺指數(shù)的影響（±s）Table 3 Effect of UCP and ACP on the generation of serum hemolysin and the thymus and spleen index in mice（±s）

表3 UCP、ACP對小鼠血清溶血素生成及脾臟、胸腺指數(shù)的影響（±s）Table 3 Effect of UCP and ACP on the generation of serum hemolysin and the thymus and spleen index in mice（±s）

注：①、②、③、④、⑥表示分別與⑴、⑵、⑶、⑷、⑹組比較，p＜0.05。

組別 數(shù)量（只） 劑量[mg/（kg·d）] 540nm OD值 脾臟指數(shù) 胸腺指數(shù)正常對照 10 等體積蒸餾水 1.5022±0.2682 48.72±6.69 15.90±4.82模型對照 10 等體積蒸餾水 0.5262±0.1905① 38.71±7.36① 11.05±4.23①茯苓多糖口服液 11 80 1.1332±0.2406② 40.13±4.19 14.84±4.02②UCP低劑量 10 50 1.0270±0.2930② 36.84±5.35 14.18±2.03②UCP中劑量 10 100 1.0956±0.2741② 39.62±3.47 13.38±3.05 UCP高劑量 11 200 0.9555±0.4071② 43.56±9.60 9.78±2.96③ACP低劑量 10 50 1.3987±0.2964②③④ 40.41±4.00 11.92±4.00 ACP中劑量 10 100 1.1974±0.4252② 43.64±7.17 13.00±2.51 ACP高劑量 10 200 1.2594±0.2217②⑥ 43.65±7.98 12.48±2.46

實驗結(jié)果表明，與正常對照組比較，模型對照組校正廓清指數(shù)α顯著降低（p＜0.05），表明免疫功能低下模型造模成功。與模型對照組比較，ACP高劑量組和茯苓多糖口服液組的校正廓清指數(shù)α顯著性升高（p＜0.05），說明ACP高劑量可顯著增強(qiáng)免疫功能低下小鼠的碳廓清能力，提示它們對小鼠單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)功能具有提高作用。UCP、ACP相同劑量之間比較，未見顯著性差異（見表4）。

表4 UCP、ACP對小鼠碳廓清能力的影響（±s）Table 4 Effect of UCP and ACP on the carbon clearance ability of mice（±s）

表4 UCP、ACP對小鼠碳廓清能力的影響（±s）Table 4 Effect of UCP and ACP on the carbon clearance ability of mice（±s）

注：①、②、③表示分別與⑴、⑵、⑶組比較，p＜0.05；表5同。

組別 數(shù)量（只）劑量[mg/（kg·d）]校正廓清指數(shù)α正常對照 10 等體積蒸餾水 5.28±0.67模型對照 9 等體積蒸餾水 4.75±0.34①茯苓多糖口服液 10 80 5.33±0.64②UCP低劑量 10 50 4.92±0.29 UCP中劑量 10 100 4.61±0.66①③UCP高劑量 10 200 4.94±0.47 ACP低劑量 10 50 4.93±0.36 ACP中劑量 10 100 4.88±0.53 ACP高劑量 10 200 5.24±0.58②

2.5 NK細(xì)胞活性測定

表5 UCP、ACP對小鼠NK細(xì)胞活性的影響（±s）Table 5 Effect of UCP and ACP on NK cells killing activity of mice（±s）

表5 UCP、ACP對小鼠NK細(xì)胞活性的影響（±s）Table 5 Effect of UCP and ACP on NK cells killing activity of mice（±s）

NK細(xì)胞殺傷活性（%）正常對照 6 等體積蒸餾水 20.78±1.46模型對照 6 等體積蒸餾水 16.45±2.07①茯苓多糖口服液 6 80 19.74±1.45②UCP低劑量 6 50 17.06±1.71③UCP中劑量 6 100 18.31±1.84 UCP高劑量 6 200 20.04±1.85②ACP低劑量 6 50 17.45±1.85③ACP中劑量 7 100 18.45±1.47②ACP高劑量 7 200 19.02±2.37②組別 數(shù)量（只）劑量[mg/（kg·d）]

與正常對照組比較，模型對照組NK細(xì)胞活性顯著降低（p＜0.05），表明免疫功能低下造模成功。與模型對照組比較，UCP高劑量組、ACP中劑量組、ACP高劑量組和茯苓多糖口服液組的NK細(xì)胞殺傷活性均顯著提高（p＜0.05），提示這些供試品對NK細(xì)胞功能具有提高作用。UCP、ACP相同劑量之間比較，未見顯著性差異，見表5。

由流式細(xì)胞術(shù)分析各組靶細(xì)胞死亡率可以看出，UCP高劑量組、ACP中劑量組、ACP高劑量組和茯苓多糖口服液組的靶細(xì)胞死亡率均顯著提高（p＜0.05），而靶細(xì)胞死亡率減去自然死亡率越高，表明NK細(xì)胞殺傷活性越強(qiáng)。UCP、ACP相同劑量之間比較，則未見顯著性差異，詳見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)分析各組中靶細(xì)胞死亡率Table 1 Death rate map of target cells in each group by flow cytometry analysis

本研究發(fā)現(xiàn)，UCP高劑量和ACP低、中、高劑量均可顯著增強(qiáng)免疫功能低下小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，提示這些供試品對小鼠的細(xì)胞免疫功能具有提高作用，且ACP中劑量作用明顯優(yōu)于UCP中劑量。UCP和ACP低、中、高劑量對免疫功能低下小鼠的血清溶血素生成量均具有顯著提高作用，提示它們對小鼠的體液免疫功能具有提高作用，且ACP低、高劑量的作用優(yōu)于UCP低、高劑量。ACP高劑量對免疫功能低下小鼠的碳廓清能力具有顯著提高作用，提示ACP高劑量對小鼠單核—巨噬細(xì)胞功能具有提高作用。UCP高劑量和ACP中、高劑量可顯著提高免疫功能低下小鼠NK細(xì)胞活性，提示這些供試品對NK細(xì)胞活性具有提高作用。UCP低劑量具有增加免疫功能低下小鼠胸腺重量的作用。

研究還觀察到，靈芝多糖提取物對小鼠免疫功能的增強(qiáng)作用并不是劑量越大越好，而是存在最適劑量。本研究中，中劑量組[100mg/（kg·d）]ACP對小鼠耳腫脹度提高效果最好，高劑量組[200mg/（kg·d）]反而作用減弱。UCP低劑量組[50mg/（kg·d）]的胸腺指數(shù)明顯升高，效果最好，中劑量組和高劑量組反而下降。這一發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)[9]報道類似，為靈芝多糖的開發(fā)應(yīng)用在劑量上提供了實驗依據(jù)，也就是說在實際應(yīng)用時劑量并非越大越好。

3 結(jié)論

免疫功能主要包括特異性免疫和非特異性免疫。DTH可反映細(xì)胞免疫功能的強(qiáng)弱，溶血素生成反映了體液免疫功能狀況，兩者均為特異性免疫；碳廓清能力和NK細(xì)胞活性可反映非特異性免疫功能狀況。胸腺和脾臟是重要的免疫器官，其臟器指數(shù)也可以從一個側(cè)面反映機(jī)體的免疫功能強(qiáng)弱。

參照中華人民共和國衛(wèi)生部保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范（2003年版）[10]關(guān)于增強(qiáng)免疫力功能評價實驗結(jié)果判定的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)本研究結(jié)果可判定靈芝多糖ACP和UCP均具有增強(qiáng)免疫力的作用。從綜合比較來看，堿提法得到的靈芝多糖ACP的免疫增強(qiáng)作用優(yōu)于超聲提取的靈芝多糖。

至于兩種工藝得到的靈芝多糖提取物增強(qiáng)免疫功能的機(jī)理是什么，是否與提取工藝不同導(dǎo)致多糖的種類、結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，還有待于進(jìn)一步研究。

[1]LI Yan-qun，LU Fang，ZHANG Ke-chang.富含半乳糖的液體深層培養(yǎng)的靈芝胞外多糖的結(jié)構(gòu)與生物活性研究[J].碳水化合物聚合物：英文版，2007，68：323-328.

[2]BAO Xin-feng，WANG Xue-song，DONG Qun，等.靈芝免疫活性多糖的結(jié)構(gòu)特性研究[J].物理化學(xué)：英文版，2002，59：175-181.

[3]張璐璐，龐秀炳，尹登科，等.靈芝多糖對腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響和體外抗氧化活性的研究[J].藥物生物技術(shù)，2008，15（6）：435-438.

[4]楊琬芳，王桂琴，郝芳.靈芝多糖和DCN合用對荷瘤小鼠免疫功能影響的實驗研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，4（4）：245-247.

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[7]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學(xué)[M].第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002.

[8]中華人民共和國衛(wèi)生部藥政管理局.中藥新藥研究指南（藥學(xué) 藥理學(xué) 毒理學(xué)）[M].1993.

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[10]中華人民共和國衛(wèi)生部，保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范[S]. 2003.

Study on two kinds of Ganoderma lucidum polysaccharides on immune enhancement of mice

HUANG Sheng-quan1，PAN Hua-xin2，ZHOU Lian2，*
（1.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China；2.Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

To investigate the immune enhancement effects of two polysaccharides in mice，they were ultrasonic assisted extracted polysaccharide from Ganoderma Lucidum（UCP）and alkaline extracted polysaccharide from Ganoderma Lucidum（ACP）.The experimented mice were divided into nine groups.Two kinds of Ganoderma lucidum polysaccharide extracts were gastric feed at low，middle，high-doses.The purpose was to test their different effects on the following aspects：murine delayed type hypersensitivity ability（DTH）；monocytemacrophage carbon clearance capacity；contents of serum hemolysin；NK cell activity.There were significant differences between serum hemolysin of UCP and ACP in high，medium，low dosages treatment；murine delayed type hypersensitivity ability of ACP in high，medium，low dosages and UCP in high dosage；murine monocytemacrophage carbon clearance capacity of ACP in high dosage；NK cell activity of UCP in high dosage and ACP in high，medium dosages；thymus gland index of UCP in low dosage treatment were significantly higher than that of the contrasted groups（p＜0.05）.This result indicated the two Ganoderma lucidum polysaccharides might enhance immune function in mice，and the effects of ACP was better than that of UCP.It also indicated that the higher doses of Ganoderma lucidum polysaccharide didn’t mean the better effect of immune enhancement of mice，it should be a suitable dose.

Ganoderma Lucidum polysaccharide；immunocompetence；delayed type hypersensitivity（DTH）；carbon clearance capacity；contents of serum hemolysin；NK cells activity

TS201.4

A

1002-0306（2012）03-0355-04

2011－01－06 *通訊聯(lián)系人

黃生權(quán)（1977-），男，博士，主要從事中草藥功能食品的研究與開發(fā)。

國家自然科學(xué)基金項目（30873415）。