棗果皮結(jié)合酚的大鼠體內(nèi)吸收及抗氧化能力研究

朱春秋，程 代，蔡曉菲，姜微波

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

棗果皮結(jié)合酚的大鼠體內(nèi)吸收及抗氧化能力研究

朱春秋，程 代，蔡曉菲，姜微波*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

為了解棗果皮結(jié)合酚（JPBP）在體內(nèi)的吸收情況及其對大鼠血漿總抗氧化能力的影響，用JPBP（500mg/kg·bw）對大鼠進(jìn)行灌胃處理，分別在灌胃后5、10、15、25、40、60min抽取血樣，檢測血漿的總抗氧化能力，并用高效液相色譜分析血漿中JPBP的吸收情況。結(jié)果顯示：灌胃JPBP后5～60min內(nèi)，大鼠血漿總抗氧化能力均顯著提高（p＜0.05）；在大鼠血漿中檢測到了JPBP的主要成分－－香豆酸；并發(fā)現(xiàn)在灌胃后15～25min之間，香豆酸在血漿中達(dá)到最大濃度。實驗結(jié)果表明，棗果皮結(jié)合酚能夠被大鼠通過消化道吸收，并具有良好的體內(nèi)抗氧化能力。

棗果皮，結(jié)合酚，總抗氧化能力，吸收

棗（Ziziphus jujube Mill）是中國的傳統(tǒng)果品之一，具有很高的營養(yǎng)與藥用保健功效，是天然的藥食同源食品[1]，植物多酚是植物體內(nèi)次生代謝的中間產(chǎn)物，由于其特殊的結(jié)構(gòu)和生物活性，具有很好的抗氧化功效[2]，研究表明棗果中含有豐富的多酚類物質(zhì)[3]，其中棗果皮中酚類物質(zhì)的總量至少為棗果肉中的五六倍以上[4]。然而，在實際生產(chǎn)中，棗果皮往往被廢棄掉，因此，研究棗果皮中酚類物質(zhì)的生物活性將有助于棗果的進(jìn)一步開發(fā)利用，提高棗果附加值。薛自萍等研究表明，棗果皮中酚類物質(zhì)具有鐵還原能力和清除DPPH·、ABTS·+自由基的能力，說明棗果皮中酚類物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗氧化能力[5]，然而，鮮有文獻(xiàn)報道棗果皮中酚類物質(zhì)體內(nèi)抗氧化能力方面的研究。本文探討了棗果皮結(jié)合酚（JPBP）對大鼠血漿總抗氧化能力（T－AOC）的影響，并用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)分析了棗果皮結(jié)合酚在大鼠血漿中的吸收情況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冬棗 采購于北京市海淀區(qū)西北旺鎮(zhèn)唐家?guī)X果園；健康清潔級Wistar大鼠12只 體重（180±20）g，由解放軍軍事科學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK－（軍）2007－004，飼養(yǎng)于SPF級動物房，環(huán)境溫度（22±2）℃，環(huán)境濕度65%±5%，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、原兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司，分析純；肝素鈉、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、無水乙醚、鹽酸、NaOH等 北京化學(xué)試劑公司，分析純；總抗氧化能力測定試劑盒 購于南京建成生物技術(shù)公司。

SK8200H超聲波發(fā)生器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE－52 上海亞榮生化儀器廠；SHB－3循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；TGL－16C離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；QL－ 901漩渦混合器、MTN－2800D氮吹儀 上海泉島科貿(mào)公司；T6－新世紀(jì)紫外可見分光光度計 北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司；高效液相色譜儀LC－20A/ SPD－M20A 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料的制備 選取大小均勻、無機(jī)械損傷、無病蟲害的冬棗，迅速用不銹鋼刀分開果皮（厚度1mm）和果肉，將果皮放于－80℃冰箱以待實驗。

1.2.2 棗果皮結(jié)合酚的提取 棗果皮中結(jié)合酚的提取參照文獻(xiàn)[6]，略有修改。準(zhǔn)確稱取200.0g棗果皮，加入甲醇－丙酮－水（體積比7∶7∶6）提取劑6L，于室溫下超聲20min提取三次[7]，所得濾渣加入4mol/L NaOH溶液1L，于室溫下避光水解4h，冰浴中用6mol/L HCl調(diào)整溶液的pH至2，用3L的乙酸乙酯－無水乙醚混合液（1∶1）萃取3次，合并萃取液，于30℃下真空濃縮至干，用去離子水定容至10mL得結(jié)合酚。

1.2.3 酚含量的測定 參照Singleton和Rossi[8]的方法，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算棗果皮結(jié)合態(tài)的酚含量，表示為每克果皮的結(jié)合酚含量（mg/g）。

1.2.4 動物實驗方法 大鼠隨機(jī)分為兩組：對照組，JPBP組，每組6只。禁食24h（自由采水）后，對照組經(jīng)口灌胃2mL去離子水，JPBP組大鼠經(jīng)口灌胃10mL/kg DW JPBP水溶液（含JPFP 50mg/mL），JPBP的灌胃計量為500mg/kg·bw。

各組大鼠于灌胃后5、10、15、25、40、60min用乙醚麻醉，眼底內(nèi)眥靜脈叢取血0.7mL，收集在肝素鈉抗凝的離心管中，3000r/min離心8min。取上清210μL和100μL分裝于2只離心管中，于－80℃冰箱中凍存，分別用于總抗氧化能力和高效液相色譜分析[9－10]。

將存有100μL血漿的離心管加入400μL甲醇渦旋2min混勻，15000r/min離心10min，取400μL上清于離心管中，50℃氮吹儀吹干，加入100μL甲醇渦旋2min后，取10μL高效液相色譜分析，外標(biāo)法定量。

1.2.6 色譜條件 Waters C18反相色譜柱（5μm，4.6× 250mm）；流動相A：1%（V∶V）的醋酸水溶液，流動相B：1%（V∶V）的醋酸甲醇溶液；總流速為0.8mL/min；檢測波長為280nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10μL；洗脫梯度：B相0～15min 10%～18%，15～35min 18%～25%，35～45min 25%～35%，45～60min 35%～50%，60～65min 50%～65%，65～75min 65%～95%，隨后75～90min回落到起始濃度。

1.2.7 香豆酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精確稱取香豆酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.0mg置于100mL容量瓶中，甲醇定容得濃度為0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備母液。將標(biāo)準(zhǔn)母液稀釋成1、2、5、10、20μg/mL各濃度標(biāo)準(zhǔn)液，按1.2.6條件測定，以峰面積對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 統(tǒng)計分析 結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6），應(yīng)用SPSS17.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行Duncans’差異顯著性分析，p＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 灌胃棗果皮結(jié)合酚對大鼠血漿總抗氧化能力的影響

已有研究表明，棗果皮結(jié)合酚在體外具有優(yōu)異的抗氧化能力[5]，本實驗旨在探討棗果皮結(jié)合酚在大鼠體內(nèi)的吸收情況以及吸收后對血漿總抗氧化能力的影響。根據(jù)總酚含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.0039X+0.0053，其中：Y—吸光值；X—濃度（μg·mL－1），計算出棗果皮中結(jié)合酚的含量為4.2mg/g，將此棗果皮結(jié)合酚水溶液稀釋至含結(jié)合酚50mg/mL后灌胃予大鼠。

實驗觀察到，與對照組相比，灌胃500mg/kg[9]棗果皮結(jié)合酚后5～60min內(nèi)，大鼠血漿總抗氧化能力均有顯著提高（p＜0.05），灌胃后10～25min期間的總抗氧化能力顯著高于灌胃后5、40、60min時的總抗氧化能力。

機(jī)體總抗氧化能力取決于機(jī)體內(nèi)的抗氧化劑，主要包括抗氧化酶類和非酶類抗氧化劑（如VC，多酚等）[11]，抗氧化劑在維持體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡中發(fā)揮重要的作用，主要是通過抑制自由基的產(chǎn)生或清除自由基，提高內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)水平來完成[12]，又有研究表明多酚能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)合成內(nèi)源性抗氧化劑[13]。為了分析血漿抗氧化能力升高的原因，進(jìn)而對血漿進(jìn)行了HPLC分析。

圖1 灌胃棗果皮結(jié)合酚對大鼠血漿總抗氧化能力的影響Fig.1 Effect of JPBP on total antioxidant capacity in plasma

2.2 灌胃棗果皮結(jié)合酚對大鼠血漿HPLC譜圖的影響

多酚以游離酚和結(jié)合酚的形式存在于植物體中[6]，棗果皮中的酚類物質(zhì)現(xiàn)已分析出的游離酚有兒茶素、表兒茶素[5]、沒食子酸、原兒茶素[14]，結(jié)合酚有香豆酸[5]。對棗果皮中可能存在的酚進(jìn)行單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液的HPLC上樣分析，結(jié)果表明，棗果皮結(jié)合酚HPLC譜圖中37.52min處的峰與香豆酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時間、峰形及峰的最大吸收波長相吻合，說明香豆酸是棗果皮結(jié)合酚成分之一。與對照組大鼠血漿的HPLC譜圖相比，灌胃棗果皮結(jié)合酚后大鼠血漿的譜圖中37.52min檢測到了香豆酸的吸收，即棗果皮結(jié)合酚中的香豆酸吸收進(jìn)入血液。

2.3 灌胃棗果皮結(jié)合酚后大鼠血漿中香豆酸的血藥濃度與時間的關(guān)系

根據(jù)香豆酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=（5e－005）X+0.4453，其中：Y—濃度（μg·mL－1）；X—峰面積?？捎嬎愠霾煌⊙獣r間下香豆酸的血藥濃度，灌胃棗果皮結(jié)合酚后5min的大鼠血漿中即能檢測到香豆酸的吸收，且在灌胃后15～25min之間血藥濃度達(dá)到最大。

圖2 灌胃棗果皮結(jié)合酚后對大鼠血漿的HPLC譜圖的影響Fig.2 Effect of JPBP on HPLC spectrogram of plasma

圖3 香豆酸在大鼠體內(nèi)的血藥濃度－時間曲線Fig.3 The plasma concentration－time chart of p－Coumaric acid in rat

通過SPSS17.0軟件對血漿總抗氧化能力的升高與血漿中香豆酸濃度進(jìn)行相關(guān)性分析，得出R=0.738（皮爾遜，雙尾檢驗）。證明血漿總抗氧化能力的升高與香豆酸的濃度具有一定相關(guān)性，由此推斷灌胃棗果皮結(jié)合酚后大鼠血漿總抗氧化能力的升高的原因，一方面是由于棗果皮結(jié)合酚吸收入血后直接抑制了自由基的產(chǎn)生或清除了自由基；另一方面是其誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)合成內(nèi)源性抗氧化劑，從而提高了血漿的總抗氧化能力。

3 結(jié)論

本實驗通過分析灌胃棗果皮結(jié)合酚后大鼠血漿總抗氧化能力的變化及其在大鼠體內(nèi)的吸收情況，證明了棗果皮結(jié)合酚能夠被大鼠通過消化道吸收，并具有良好的體內(nèi)抗氧化能力。

[1]苗明山，孫麗敏.大棗的現(xiàn)代研究[J].河南中醫(yī)，2003，23（3）：59－60.

[2]程春龍，李俊清.植物多酚的定量分析方法和生態(tài)作用研究進(jìn)展[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2006，17（12）：2456－2460.

[3]Hudina M，Liu M，Veberic R，et al.Phenolic compounds in the fruit of different varieties of Chinese jujube（Ziziphus jujuba Mill）[J].Journal of Horticultural Science and Biotechnology，2008，83（3）：305－308.

[4]Xue ZP，F(xiàn)eng WH，Cao JK，et al.Antioxidat activity and total total phenolic contents in peel and pulp of Chinese jujube（ziziphus jujube mill）fruits[J].Food Biochem，2009，33：613－629.

[5]薛自萍，曹建康，姜微波.棗果皮中酚類物質(zhì)提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性分析[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2009，25（1）：153－157.

[6]Morimura S，Nagata H，Uemura Y，et al.Development of an effective process for utilization of collagen from livestock and fish waste[J].Process Biochemistry，2002，37：1403－1412.

[7]GB5009.5－85.食品中蛋白質(zhì)的測定方法[S].1985.

[8]劉尊英，李八方，曾名勇.鱈魚皮膠原蛋白胰蛋白酶控制水解動力學(xué)模型[J].食品科技，2008（2）：74－78.

[9]Germanòa MP，D’Angeloa V，Biasinia T.Evaluation of the antioxidant properties and bioavailability of free and bound phenolic acids from Trichilia emetica Vahl[J].Journal of Ethnopharmacology，2006，105：368－373.

[10]Kountouri AM，Mylona A，Kaliora AC，et al.Bioavailability of the phenolic compounds of the fruits（drupes）of Olea europaea（olives）：Impact on plasma antioxidant status in Humans[J]. Phytomedicine，2007，14：659－667.

[11]張英彪，李純穎，李勇.甲醛和苯對小鼠睪丸總抗氧化能力和ATP酶及鈣的影響[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，15（1）：64－69.

[12]金惠銘，盧鍵.細(xì)胞分子病理生理學(xué)[M].昆明：云南科技出版社，1997：32－48.

[13]Jiao H，Ye P，Zhao B.Protective effects of green tea polyphenols on human HepG2 cells against oxidative damage of fenofibrate[J].Free Radical Biol，2003，35：1121－1128.

[14]Zhang H，Jiang L，Ye S，et al.Systematic evaluation of antioxidant capacities of the ethanolic extract of different tissues of jujube（Ziziphus jujuba Mill）from China[J].Food and Chemical Toxicology，2010，48：1461－1465.

Study on absorption of the bound phenolics from jujube peel in rat and its antioxidant activity

ZHU Chun-qiu，CHENG Dai，CAI Xiao-fei，JIANG Wei-bo*
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

To examine absorption of the bound phenolics from jujube peel（JPBP）in vivo，the plasma samples were taken at 5，10，15，25，40，60min after the rats gavaged with JPBP（500mg/kg·bw），then were subjected for analysis of phenolics and total antioxidant capacity（T-AOC）.T-AOC in the plasma was significantly increased（P＜0.05）in 5～60min after the JPBP gavage.The p-Coumaric acid，one component of the major phenlics in JPBP，was observed by high-performance liquid chromatography analysis and its maximum level in the plasma was showed in 15～25min after the JPBP gavage.Our results indicated that JPBP could be abosorbed by rat and could enhance antioxidative activity in vivo in rat.

jujube peel；bond phenolic；T-AOC；absorption

TS201.4

A

1002－0306（2012）03－0352－03

2011－03－07 *通訊聯(lián)系人

朱春秋（1986－），女，碩士，主要從事食品功能成分研究。

國家自然科學(xué)基金項目（30871763；30700645）。