復(fù)合納米微粒修飾絲網(wǎng)印刷電極的一次性過氧化氫生物傳感器研究

張春梅，楊 欣，吳 峰，肖志杰

（1.懷化學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程系，湖南懷化418000；2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南懷化418008）

復(fù)合納米微粒修飾絲網(wǎng)印刷電極的一次性過氧化氫生物傳感器研究

張春梅1，楊 欣2,*，吳 峰1，肖志杰1

（1.懷化學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程系，湖南懷化418000；2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南懷化418008）

構(gòu)建納米金（Au）-石墨烯（GS）-辣根過氧化物酶（HRP）-Nafion納米復(fù)合物修飾絲網(wǎng)印刷電極（SPCEs）的一次性過氧化氫生物傳感器，并用于過氧化氫的測定。采用化學(xué)鍍金方法于SPCEs表面形成Au，然后將GS、HRP和Nafion組成的復(fù)合物涂覆于SPCEs/Au表面，構(gòu)建SPCEs/Au/GS/HRP/Nafion電極，采用掃描電鏡（SEM）表征化學(xué)鍍金、GS和電極的制備過程，采用循環(huán)伏安（CV）法和計時電流（i-t）法研究H2O2的電化學(xué)性質(zhì)。在優(yōu)化的實驗條件下，該電極能實現(xiàn)HRP的直接電子傳遞，對H2O2有顯著的電催化作用，在2.0×10-5～2.5×10-3mol/L濃度范圍內(nèi)對H2O2有良好的線性響應(yīng)，線性相關(guān)系數(shù)為0.9994，檢測限為1.2×10-5mol/L。該傳感器靈敏快速、制備容易、樣品用量少、可拋棄、抗干擾性強(qiáng)，有望用于食品中痕量H2O2殘留的檢測。

石墨烯，納米金，辣根過氧化物酶，Nafion，絲網(wǎng)印刷電極，過氧化氫

過氧化氫（H2O2）在食品工業(yè)、環(huán)境分析等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，同時，它也是葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶等一系列酶促反應(yīng)的重要副產(chǎn)物[1-2]。因此，發(fā)展靈敏、快速、低成本的H2O2檢測方法與儀器意義重要。目前，H2O2檢測方法包括滴定法[3]、熒光法[4]、色譜法[5-6]及電化學(xué)法[7-12]。其中，電化學(xué)法，尤其是基于各種過氧化物酶[7-10]和血紅蛋白[11-12]的電流型生物傳感器研究最為廣泛，因其具有操作簡便、靈敏度高和選擇性好等優(yōu)點。然而，酶在電極表面易失活，圓盤電極檢測時樣品需要量大以及碳納米管（CNTs）等電極修飾材料價格昂貴等因素，在一定程度上限制了該類傳感器的應(yīng)用?；诮z網(wǎng)印刷電極（SPCEs）的電化學(xué)生物傳感器具有電極集成、成本低、一次使用可拋棄且能夠?qū)崿F(xiàn)批量生產(chǎn)等優(yōu)點，為推動傳感器走向廉價、大規(guī)模應(yīng)用提供了一種具有前景的途徑[13-14]。石墨烯（GS）是一種具有優(yōu)良電化學(xué)性能的新型電極修飾納米材料，相對CNTs，其制備和使用成本大大降低，大有取代CNTs的趨勢，成為當(dāng)今理論和實驗界研究的熱點[15-16]；Nafion是一種全氟化高分子聚合物陽離子交換劑，能有效防止由于GS團(tuán)聚而導(dǎo)致的電化學(xué)性能變差，已廣泛用于石墨烯基生物傳感器表面敏感膜構(gòu)建[8，17]。納米金（Au）由于其優(yōu)良的導(dǎo)電性并能長久保持酶等生物蛋白的活性亦廣泛應(yīng)用于生物傳感器的構(gòu)建[18-19]。本研究采用化學(xué)鍍方法于SPCEs表面生成Au，然后將GS、HRP和Nafion組成的復(fù)合物涂覆于SPCEs/Au表面，首次構(gòu)建復(fù)合納米微粒修飾SPCEs的H2O2現(xiàn)場快速檢測用電化學(xué)生物傳感器（SPCEs/Au/GS/HRP/Nafion）。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣根過氧化物酶（HRP，活性≥250U/mg） 上海國藥集團(tuán)；石墨 長沙格翎電池材料有限公司；過氧化氫（30%） 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；Nafion溶液 上海河森電氣有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.1mol/L） 用NaH2PO4、Na2HPO4和NaCl配制；氯金酸、葡萄糖、抗壞血酸及其它試劑 均為分析純，上海國藥集團(tuán)；實驗用水 均為二次蒸餾水。

CHI660D電化學(xué)工作站 上海辰華儀器有限公司；三電極集成的SPCEs西班牙DropSens公司，其中工作電極為復(fù)合納米微粒修飾電極，參比電極為印刷Ag/AgCl電極，對電極為印刷碳電極；Hitachi S-3400N型能譜掃描電鏡 日本Hitachi公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 GS、GS/Nafion以及GS/HRP/Nafion復(fù)合物的制備

首先采用改進(jìn)的Hummers和Offeman法[20-21]制得氧化石墨（Graphite oxide，GO）。將0.1g GO溶解于100mL蒸餾水，超聲3h，成為均勻分散的黃色透明GO膠體溶液。將上述溶液置于250mL三頸瓶中，水浴80℃加熱，加入50μL肼還原24h，最后得黑色絮狀沉淀，洗滌、抽濾、真空干燥得到GS粉末。2.0mg GS加至1.0mL 0.5%Nafion溶液中并超聲2h形成均一穩(wěn)定的GS/Nafion復(fù)合物。再向上述復(fù)合物中加入含20mg/mL HRP的pH=6.5 PBS 1.0mL，得到GS/HRP/Nafion復(fù)合物。

圖1 石墨（a）、氧化石墨（b）、石墨烯（c）以及石墨烯+Nafion（d）水溶液的電子照片F(xiàn)ig.1 Photographic images of（a）graphite，（b）GO，（c）GS and（d）GS+Nafion in water

GS制備過程的電子照片如圖1所示，天然石墨不溶于水，在水中分散性很差，容器底部形成明顯的沉淀（1a）；GO膠體呈亮黃色，經(jīng)過氧化后已在碳原子層之間引入大量的羧基、羥基等親水性基團(tuán)而易溶于水（1b）；GS在水溶液中由于π-π共軛以及強(qiáng)的分子間作用力而容易團(tuán)聚（1c）；Nafion溶液的增溶作用明顯改善了GS的水溶性，由于其帶負(fù)電的磺酸基與石墨烯的負(fù)電荷相互排斥而有效防止了GS團(tuán)聚，得到了分散性較好的GS/Nafion溶液（1d）。

1.3 不同電極的構(gòu)建

SPCEs表面化學(xué)鍍金參照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行，將SPCEs電極浸入0.36mol/L乙二胺溶液中，室溫反應(yīng)3h取出，然后浸入1mmol/L氯金酸溶液反應(yīng)2.5h，Au3+絡(luò)合于-NH2表面，最后，浸入0.1mol/L硼氫化鈉溶液還原5min，得到Au顆粒大小為30nm的SPCEs/Au電極。均勻滴加10μL GS/HRP/Nafion復(fù)合物上述電極表面，過夜干燥即得SPCEs/Au/GS/HRP/Nafion電極。采用上述類似涂覆方法制得SPCEs/Au/HRP/Nafion、SPCEs/GS/HRP/ Nafion電極作為對比。

1.4 傳感器對H2O2的檢測

將SPCEs/Au/GS/HRP/Nafion電極置于5.0mL pH= 6.5 PBS中，采用循環(huán)伏安（CV）法檢測HRP的在電極表面的直接電子傳遞（Direct electron transfer，DET）；在上述溶液中再加入不同濃度的H2O2，CV法檢測電極對不同濃度H2O2的催化響應(yīng)；采用計時電流（i-t）法進(jìn)行H2O2定量分析。傳感器檢測系統(tǒng)及工作電極表面形貌見圖2。CV法電位范圍：0.4～0.8V，掃描速率：0.1V/s；i-t實驗電位：-0.3V；實驗前溶液通氮除氧15min，實驗過程中保持氮氣氛圍。

圖2 傳感器以及工作電極表面反應(yīng)機(jī)理示意圖Fig.2 Schematic diagram of the electrochemical biosensor apparatus（A）and the reaction mechanism on the surface of working electrode（B）

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感器制作過程各階段獲得電極的表征

圖3 SPCEs（a），SPCEs/Au（b），SPCEs/Au/GS/HRP/Nafion（c）電極表面形貌掃描電鏡圖Fig.3 SEM images of bare SPCEs（a），SPCEs/Au（b）and SPCEs/Au/GS/HRP/Nafion（c）electrode

采用掃描電鏡（SEM）分別對SPCEs、SPCEs/Au/ Nafion及SPCEs/Au/GS/HRP/Nafion電極表面進(jìn)行了表征。圖3a顯示SPCEs表面具有比較明顯的塊狀石墨結(jié)構(gòu)；在SPCEs表面化學(xué)鍍Au以后（圖3b），SPCEs/Au電極出現(xiàn)了許多分布均勻、粒徑約為30nm的白色亮點，推測是由于Au反射光產(chǎn)生。根據(jù)文獻(xiàn)[19]報道，這種均一的三維點狀結(jié)構(gòu)能使電極的有效面積增大、擴(kuò)增響應(yīng)電流。SPCEs/Au/GS/HRP/Nafion的SEM如圖3c，出現(xiàn)了分散的褶皺狀石墨烯片層結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步說明已成功合成GS，在GS表面均勻分散著粒徑約為200～400nm的納米顆粒，比Au（30nm）粒徑明顯增大，與蛋白質(zhì)粒徑相似，這說明HRP包被在電極表面。

2.2 傳感器制作過程中各階段獲得電極的電化學(xué)特性

在pH=6.5 0.1mol/L的PBS中，測定了不同電極的CV曲線（圖4）。SPCEs/HRP/Nafion電極（a）沒有出現(xiàn)HRP的氧化還原峰，推斷是因為HRP的電化學(xué)活性中心被深深地包埋在蛋白質(zhì)的核殼結(jié)構(gòu)中，這使得酶的活性中心與電極表面之間的距離比電子能傳遞的有效距離遠(yuǎn)，而且，由于Nafion的不導(dǎo)電進(jìn)一步阻礙了其電子的傳遞[7]；SPCEs/Au/HRP/Nafion電極（b）以及SPCEs/GS/HRP/Nafion電極（c）均在－0.3V附近出現(xiàn)明顯的還原峰電流，能明顯觀察到HRP的DET；與上述電極相比SPCEs/Au/GS/HRP/Nafion電極的還原峰電流最強(qiáng)，HRP的DET現(xiàn)象更為明顯。實驗考察得到不同濃度的H2O2在SPCEs/Au/GS/ HRP/Nafion電極上CV曲線的還原峰電流隨著其濃度的增加而增大（圖5），說明H2O2能被催化還原。

圖4 SPCEs/HRP/Nafion（a），SPCEs/Au/HRP/Nafion（b），SPCEs/GS/HRP/Nafion（c），SPCEs/Au/GS/HRP/Nafion（d）在0.1mol/L PBS中的循環(huán)伏安圖Fig.4 CVs of SPCEs/HRP/Nafion（a），SPCEs/Au/HRP/Nafion（b），SPCEs/GS/HRP/Nafion（c）and SPCEs/Au/GS/HRP/Nafion（d）in 0.1mol/L PBS at a scan rate of 0.1V/s

2.3 電極的制備及測定條件優(yōu)化

圖5 SPCEs/Au/GS/HRP/Nafion電極對0mmol/L（a），0.1mmol/L（b），0.2mmol/L（c），0.3mmol/L（d）H2O2的循環(huán)伏安響應(yīng)Fig.5 CVs of SPCEs/Au/GS/HRP/Nafion with successive addition of 0.1mmol/L H2O2in 0.1mol/L PBS at pH 6.5 at a scan rate of 0.1V/s

2.3.1 化學(xué)鍍Au的粒徑 Gu H Y等[23]研究發(fā)現(xiàn)，小尺寸的Au（大約30nm）能給予HRP等蛋白質(zhì)等生物活性分子更多的取向自由度，從而增加輔基靠近金膠的機(jī)會，使電子方便地通過Au的傳輸通道，最大幅度地擴(kuò)增響應(yīng)電流。而我們化學(xué)鍍合成的單分散Au粒徑在30nm左右，故具有較好的電子傳遞性能，能較大幅度地擴(kuò)增響應(yīng)電流。

2.3.2 電極表面GS/HRP/Nafion的滴加量 電極表面GS/HRP/Nafion滴加量會影響H2O2的響應(yīng)電流，由圖6可見，0.5mmol/L H2O2的還原峰電流隨著GS/HRP/Nafion滴加量的增加而變大，這是由于電極表面的催化活性位點隨著GS和HRP的增加而增多，當(dāng)用量超過10μL時，電流反而降低，這可能是因為電極表面不導(dǎo)致的Nafion增多反而阻礙了電子傳遞，故本實驗選用10μL GS/HRP/Nafion復(fù)合物涂覆到SPCEs/Au電極表面。

圖6 GS/HRP/Nafion量對響應(yīng)電流的影響Fig.6 Effect of the volume of GS/HRP/Nafion on CV current

圖7 pH對響應(yīng)電流的影響Fig.7 Effect of pH on CV current

圖8 溫度對響應(yīng)電流的影響Fig.8 Effect of temperature on CV current

2.3.3 pH的選擇 考察了緩沖溶液pH對0.5mmol/L H2O2響應(yīng)電流的影響，如圖7所示，當(dāng)緩沖溶液的pH= 6.5時，修飾電極對H2O2的還原電流達(dá)到最大，推測是因為HRP活性在pH=6.5時保持最佳。因此，選擇pH= 6.5的PBS作為檢測實驗的底液。

2.3.4 溫度的選擇 考察了酶電極在15～40℃范圍內(nèi)對0.5mmol/L H2O2的響應(yīng)電流（圖8），實驗結(jié)果表明溫度在25℃時響應(yīng)電流達(dá)到最大，說明此時HRP活性最強(qiáng)，因此選擇實驗在25℃時進(jìn)行。

2.4 H2O2的測定

在優(yōu)化的實驗條件下，采用i－t法研究了酶電極的電流響應(yīng)與H2O2濃度之間的關(guān)系，結(jié)果如圖9所示。在一直保持氮氣氛圍的攪拌底液中，每隔30s加入一定濃度的H2O2，酶電極所產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)電流隨H2O2的加入呈臺階狀增加，電流響應(yīng)迅速，在3s內(nèi)可達(dá)到穩(wěn)定響應(yīng)，響應(yīng)電極與H2O2濃度在2.0×10－5～2.5× 10－3mol/L濃度范圍有良好的線性響應(yīng)，線性相關(guān)系數(shù)為0.9994，檢測限為1.2×10－5mol/L（S/N=3），線性回歸方程為：i=2.2375×10－7+4.8179×10－6C（C單位：mmol/L），以上結(jié)果優(yōu)于相關(guān)文獻(xiàn)[2，11]的報道。

圖9 SPCEs/Au/GS/HRP/Nafion電極對連續(xù)加入H2O2的電流－時間曲線Fig.9 i－t response of SPCEs/Au/GS/HRP/Nafion for successive addition of H2O2in pH=6.5 0.1mol/L PBS.Inset：Calibration curve between current and CH2O2 operating potential：－0.3V

2.5 電極的精密度、制備重復(fù)性、穩(wěn)定性和抗干擾性

精密度：采用同一根電極分別測定0.5mmol/L H2O2五次，得到其組內(nèi)變異系數(shù)分別為3.0%、3.2%和2.5%，說明該酶電極具有良好的精密度。

制備重復(fù)性：由于使用的SPCEs是同一批次印制，因此彼此結(jié)構(gòu)完全相同（包括電極材料、面積和碳層厚度等），且只使用一次即拋棄。所以我們比較了采用5個同一批次制備的H2O2傳感器，對0.5mmol/L的H2O2進(jìn)行測定，獲得組間變異系數(shù)為2.5%（n=3），說明該酶電極具有較好的制備重復(fù)性。

穩(wěn)定性：酶電極在4℃冰箱中存放15d后對0.5mmol/L H2O2測定時的電流響應(yīng)值為初始值的94%；存放30d后僅下降為原來的90%。表明制作的酶電極在30d內(nèi)比較穩(wěn)定，電極表面HRP的生物活性保持良好，這可能是由于Au具有優(yōu)良的生物兼容性。

抗干擾性：于0.5mmol/L H2O2中分別加入1.0mmol/L葡萄糖、檸檬酸、抗壞血酸等干擾物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)對測定無干擾，說明電極具有良好的選擇性。

2.6 實際樣品檢測

表1 實際樣品中H2O2檢測結(jié)果（N=6，mol/L）Table1 DeterminationresultsofH2O2inrealsamples（N=6，mol/L）

為驗證本方法在實際檢測中的可行性，對某雙氧水隱形眼鏡護(hù)理液中H2O2含量進(jìn)行測定（表1）。采用傳統(tǒng)的高錳酸鉀滴定法測得其中H2O2含量為0.90mol/L。采用本實驗構(gòu)建的傳感器，在最佳實驗條件下采用i－t法測定5次，均值為0.91mol/L，樣品回收率（檢出量/加入量×100%）在96%～102%之間，說明本方法可用于實際樣品中H2O2的現(xiàn)場快速測定。

3 結(jié)論

制作了SPCEs/Au/GS/HRP/Nafion一次性安培型酶電極，并對實際樣品中痕量H2O2含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果令人滿意。與常規(guī)H2O2檢測電極相比具有以下優(yōu)勢：該一次性電極廉價（成本＜3元/片），小巧且集成度高（pH試紙大小且集成三電極），樣品需要量少（μL級），用后可拋棄，避免了同一電極檢測多個樣本時交叉干擾問題，且同一批次制作的電極結(jié)果重現(xiàn)性良好；采用復(fù)合納米微粒修飾電極，靈敏度提高，電極保存時間延長，電極表面的Nafion膜顯著降低了帶負(fù)電荷的抗壞血酸、多巴胺等的干擾。綜上所述，本研究構(gòu)筑的一次性電極是實現(xiàn)H2O2現(xiàn)場、快速、超靈敏檢測可選用的最佳途徑之一。本文構(gòu)建的平臺技術(shù)具有通用性，只要改變檢測對象種類，即可進(jìn)一步推廣至葡萄糖等其它食品的檢測并可以作為光譜、色譜等方法的有益補(bǔ)充，在食品分析方面具有重要的理論和實際價值。

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Study on a disposable hydrogen peroxide biosensor based on Au-graphene-HRP-Nafion biocomposites modified screen-printed carbon electrodes

ZHANG Chun-mei1，YANG Xin2，*，WU Feng1，XIAO Zhi-jie1
（1.Department of Chemistry and Chemical Engineering，Huaihua College，Huaihua 418000，China；
2.Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province，Huaihua University，Huaihua 418008，China）

A disposable biosensor for determination of hydrogen peroxide（H2O2）based on gold nanoparticles（Au）-graphene sheets（GS）-horseradish peroxidase（HRP）-Nafion biocomposites modified screen-printed carbon electrodes（SPCEs）was fabricated.To construct the H2O2biosensor，GS and HRP were co-immobilized into biocompatible Nafion，then the SPCEs was modified by the biocomposite，followed by electroless plating of Au on the surface to fabricate SPCEs/Au/GS/HRP/Nafion electrode.Different technologies were employed to study the synthesis of GS，construction processes and the electrochemical properties of the biosensor.Under the optimized experimental conditions，Cyclic voltammetry（CV）demonstrated that the direct electron transfer（DET）of HRP was realized，and the biosensor had an excellent performance in terms of electrocatalytic reduction towards H2O2.The linear response of the biosensor to H2O2was in the concentration range of 2.0×10-5～2.5×10-3mol/L（R2=0.9994）with a detection limit of 1.2×10-5mol/L.The proposed electrochemical biosensor was sensitive，quickly，disposable with low cost，fewer sample volume，easy preparation and strong anti-interference，which shows great promise for screen-determination of trace H2O2in real samples.

graphenesheet；goldnanoparticles；horseradishperoxidase；Nafion；screen-printedcarbonelectrodes；hydrogen peroxide

TS207.3

A

1002-0306（2012）03-0317-05

2011－02－14 *通訊聯(lián)系人

張春梅（1968-），女，中級實驗師，主要從事新型納米材料制備研究。

湖南省教育廳科研基金（10C1059）；湖南省高?！爸兴幹苿┕こ膛c質(zhì)量控制”產(chǎn)學(xué)研合作示范基地建設(shè)項目；懷化學(xué)院資助科研項目（HHUY2011-08）。