超聲和均質(zhì)對蕓豆凝集素粗提物的影響

劉岑岑，任嬌艷，趙謀明

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

超聲和均質(zhì)對蕓豆凝集素粗提物的影響

劉岑岑，任嬌艷*，趙謀明

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640）

采用兩種工藝對四種蕓豆中的凝集素進(jìn)行提取，優(yōu)化得到最佳的提取工藝；在此基礎(chǔ)上研究了超聲處理（包括料液比、超聲功率、超聲時間三個因素）和均質(zhì)處理（包括均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)兩個因素）對蕓豆凝集素粗提物的得率及血凝活性的影響。結(jié)果表明：中山產(chǎn)紅蕓豆經(jīng)過先勻漿再浸提工藝所得凝集素粗品得率最高，血凝活性最強(qiáng)；超聲在一定范圍內(nèi)可以提高凝集素粗品得率和血凝活性，兩者在料液比1∶15、超聲功率325W、超聲時間20min時有最大值；均質(zhì)作用對蕓豆凝集素粗品得率影響不大，在大于40MPa均質(zhì)壓力下循環(huán)作用兩次血凝活性降低。

蕓豆凝集素，超聲，均質(zhì)，得率，血凝活性

蕓豆（Phaseolus vulgaris L.），又稱腰豆、腎豆，屬于菜豆屬蝶形花科，原產(chǎn)于美洲的墨西哥、阿根廷。我國在16世紀(jì)末開始引進(jìn)種植，主要種植地有四川、陜西、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古，主要品種包括大白蕓豆、大黑花蕓豆、紅蕓豆[1-2]。蕓豆籽粒營養(yǎng)豐富，而且具有抗腫瘤等藥用價值，近年來研究結(jié)果表明這與蕓豆中的凝集素有一定關(guān)系。蕓豆凝集素（Phytohemagglutinin，PHA）是一類可促使紅細(xì)胞凝集的糖蛋白[3]，具有促進(jìn)免疫反應(yīng)，誘發(fā)人外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗癌淋巴因子以及抗HIV病毒等生物學(xué)活性[4-5]。同時，凝集素也是一類抗?fàn)I養(yǎng)因子，其毒性主要是通過抑制腸道表面目標(biāo)糖蛋白的消化和腸道刷狀緣膜的活性，從而妨礙營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[6-7]?，F(xiàn)代食品加工常常采用一些物理加工技術(shù)來改變食品的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味以及營養(yǎng)價值，超聲和均質(zhì)技術(shù)就是目前常用的兩種加工手段。超聲作用的機(jī)制主要包括機(jī)械傳質(zhì)作用、加熱作用和空化作用[8]；而均質(zhì)作用的物理機(jī)制主要是利用液體物料流過狹縫受到的強(qiáng)大剪切力、撞擊力以及壓力突變產(chǎn)生的空穴爆炸力等綜合作用導(dǎo)致大分子結(jié)構(gòu)的變化[9]。本文利用超聲和均質(zhì)技術(shù)對蕓豆進(jìn)行加工處理，以凝集素粗品得率及血凝活性為指標(biāo)研究其對蕓豆凝集素的影響，為蕓豆的生產(chǎn)加工提供指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅蕓豆、花蕓豆 產(chǎn)地中山；紅蕓豆、大白蕓豆產(chǎn)地內(nèi)蒙古；血紅細(xì)胞（glutaraldehyde treated human group AB） Sigma公司；胰酶（pancreatin） 中性蛋白酶活力為2×103U/g，杭州三葉生物化工廠；0.9%的氯化鈉溶液（生理鹽水）；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。高速冷凍離心機(jī) 德國博勵行公司；超低溫冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；DFT200型手提式高速萬能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；組織搗碎勻漿機(jī) 日本松下National公司；XO－640D型超聲波細(xì)胞破碎儀 南京市先歐生物科技有限公司；APV－1000型均質(zhì)機(jī) 丹麥APV產(chǎn)品公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蕓豆凝集素的提取

1.2.1.1 工藝一 先勻漿后浸提。蕓豆→去皮→按1∶10（m/v）加入生理鹽水→勻漿→4°C浸提48h→四層紗布過濾→離心（10000r/min，40min）→冷凍干燥→凝集素粗品

1.2.1.2 工藝二 先磨粉后浸提。蕓豆→去皮→粉碎→按1∶10（m/v）加入生理鹽水→磁力攪拌1h→4°C浸提48h→四層紗布過濾→離心（10000r/min，40min）→冷凍干燥→凝集素粗品

1.2.2 血凝活性的測定 參照孫冊等的方法[10]加以改進(jìn)。用4×103U/L胰蛋白酶溶液處理紅細(xì)胞，增強(qiáng)紅細(xì)胞的敏感性[11]。以50%凝集作為判定終點，計算凝集效價和最低效價濃度。其中凝集效價以2n（n為血凝板上樣品產(chǎn)生凝集現(xiàn)象的最大稀釋倍數(shù)）表示。

1.2.3 超聲對凝集素粗品的影響 以料液比（1∶3、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20）、超聲功率（195、260、325、390、455W）和超聲時間（5、10、15、20、25min）三個因素分別考察超聲作用對凝集素粗品得率和血凝活性的影響。

1.2.4 均質(zhì)對凝集素粗品的影響 以均質(zhì)壓力（10、20、30、40、50MPa）和循環(huán)次數(shù)（循環(huán)一次和循環(huán)兩次）兩個因素研究均質(zhì)對凝集素粗品得率和血凝活性的影響。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 每個實驗重復(fù)三次，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行One－way ANOVA分析。用LSD檢驗來確定數(shù)據(jù)間的差異，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取工藝對蕓豆凝集素得率的影響

圖1 不同工藝提取的四種蕓豆凝集素粗品得率的比較Fig.1 The comparison of crude PHA yields from four kinds of kidney bean by different extraction methods

由圖1和表1可知，將蕓豆先勻漿后浸提（工藝一）得到的四種凝集素粗品的得率與將蕓豆先磨粉后浸提（工藝二）所得相似，平均略低1%左右，但是血凝活性均更高，凝集效價平均高1個單位。其原因可能有兩個：粉碎粒度越小，溶出的其他雜蛋白質(zhì)及糖類也相對越多，因而得率更高，但其中蕓豆凝集素在粗提物中的比例反而下降；高速粉碎機(jī)轉(zhuǎn)速很高，在粉碎過程中產(chǎn)生的短時高熱使蕓豆中部分凝集素失活。就四種蕓豆進(jìn)行比較，中山產(chǎn)紅蕓豆得率和血凝活性均最高，因此在后續(xù)實驗中選取中山產(chǎn)紅蕓豆以工藝一提取凝集素粗品。

表1 不同工藝提取的四種蕓豆凝集素粗品（25mg/mL）的血凝活性Table 1 The hemagglutination activities of crude PHA from four kidney beans by different extraction methods（25mg/mL）

2.2 超聲對蕓豆凝集素粗品得率及血凝效果的影響

2.2.1 料液比對蕓豆凝集素粗品得率及血凝效果的影響 在超聲時間15min，超聲功率325W的條件下以不同料液比提取蕓豆凝集素，研究料液比對其粗品得率及血凝效果的影響。

圖2 料液比對蕓豆凝集素粗品得率的影響Fig.2 The effects of the ratio of solid to liquid on the yield of crude PHA

由圖2可知，蕓豆凝集素粗品得率隨著料液比的增大而增加。當(dāng)料液比為1∶15時均基本達(dá)到最大值，超聲組與對照組得率分別為26.20%和22.68%；繼續(xù)增大料液比，凝集素粗品得率無顯著增加（P＞0.05），說明增大料液比有助于細(xì)胞內(nèi)溶物的溶出。與對照組比較，超聲處理可顯著增大蕓豆凝集素粗品得率，可能原因是超聲波的空化效應(yīng)產(chǎn)生的微聲流現(xiàn)象促進(jìn)了細(xì)胞的破碎，使細(xì)胞內(nèi)溶物質(zhì)釋放出來[12]。

表2 料液比對蕓豆凝集素粗品（25mg/mL）血凝活性的影響Table 2 The effects of the ratio of solid to liquid on hemagglutination activities of crude PHA（25mg/mL）

由表2可知，一方面，增大料液比在一定程度上可以增大凝集素粗品的血凝活性；另一方面，與對照組比較，超聲處理可使其血凝活性進(jìn)一步增強(qiáng)。當(dāng)料液比為1∶15時，經(jīng)超聲處理的凝集素粗品血凝活性最強(qiáng)，凝集效價為29，最低效價濃度為0.05mg/mL，比對照增強(qiáng)3個單位。綜合比較，在料液比1∶15的超聲作用下可以顯著提高蕓豆凝集素的得率和血凝活性。2.2.2 超聲功率對蕓豆凝集素粗品得率及血凝活性的影響 在料液比為1∶15，超聲時間15min條件下，調(diào)節(jié)超聲功率從30%增大到70%（總功率為650W），比較超聲功率對蕓豆凝集素粗品得率和血凝活性的影響。

圖3 超聲功率對蕓豆凝集素粗品得率的影響Fig.3 The effects of ultrasonic power on the yield of crude PHA

由圖3可知，超聲功率從195W增加到325W，凝集素粗品得率顯著增大，繼續(xù)增大凝集素粗品的得率增加不顯著（P＞0.05）。此時其得率為26.20%，比初始時（超聲功率195W）增大了13%，比對照增大了15%。

表3 超聲功率對蕓豆凝集素粗品（25mg/mL）血凝活性的影響Table 3 The effects of extraction power on hemagglutination activities of crude PHA（25mg/mL）

圖4 超聲時間對蕓豆凝集素粗品得率的影響Fig.4 The effects of ultrasonic time on the yield of crude PHA

由表3可知，當(dāng)超聲功率增大到260W，蕓豆凝集素粗品的血凝活性基本達(dá)最大值，凝集效價28，最低效價濃度0.10mg/mL，比對照組增大1個單位；超聲功率繼續(xù)增加，血凝活性基本不變。綜合比較，在超聲功率為325W時可以得到最優(yōu)的得率與血凝效果。

2.2.3 超聲時間對蕓豆凝集素粗品得率及凝血活性的影響 在料液比1∶15，超聲功率325W條件下，研究超聲時間對蕓豆凝集素粗品得率及血凝活性的影響。由圖4可知，蕓豆凝集素粗品的得率隨著超聲時間的延長而增大。當(dāng)超聲時間達(dá)20min時，蕓豆凝集素粗品得率基本達(dá)到最大值（26.79%），比超聲5min時增大9.6%，比對照組增大19.3%。對比可知，超聲時間5min以上均能增大其得率，在超聲20min后得率增大不顯著（P＞0.05），這與L.Anta等[7]研究結(jié)果相一致。

表4 超聲時間對蕓豆凝集素粗品（25mg/mL）血凝活性的影響Table 4 The effects of ultrasonic time on hemagglutination activities of crude PHA（25mg/mL）

由表4可知，超聲時間在10min以下時，蕓豆凝集活性無明顯增強(qiáng)。超聲時間延長到15min時，凝集活性增強(qiáng)，凝集效價增大1個單位，最低效價濃度為0.1mg/mL；繼續(xù)增大超聲時間到20min時，凝集活性保持不變；但是當(dāng)超聲時間繼續(xù)延長至25min時，凝集活性反而降低?？赡茉蚴怯捎谑|豆凝集素為一種四聚體球蛋白，其血凝活性與聚合物的聚合和分離狀態(tài)有關(guān)，而超聲空化作用會先使球蛋白解離然后聚合，所以隨著超聲時間的延長使蕓豆凝集素的聚合狀態(tài)發(fā)生了較大的變化，進(jìn)而使血凝活性降低[13]。另外，也可能是由于超聲時間過長產(chǎn)生的局部高熱效應(yīng)使部分凝集素糖蛋白變性，而使其凝集活性降低。

2.3 均質(zhì)對蕓豆凝集素粗品得率及血凝效果的影響

圖5 均質(zhì)對蕓豆凝集素粗品得率的影響Fig.5 The effects of homogenization on the yield of crude PHA

由圖5可知，均質(zhì)作用對蕓豆凝集素粗品得率無明顯作用，可能是因為普通均質(zhì)的壓力比較低，產(chǎn)生的物理機(jī)械的作用對蕓豆細(xì)胞的破壞作用較弱，不能促進(jìn)其釋放出更多的內(nèi)溶物。

表5 均質(zhì)對蕓豆凝集素粗品（25mg/mL）血凝活性的影響Table 5 The effects of homogenization on hemagglutination activities of crude PHA（25mg/mL）

由表5可知，在只循環(huán)一次的不同均質(zhì)壓力處理下，凝集素的血凝活性基本不變，但是在較高壓強(qiáng)（40MPa和50MPa）作用下循環(huán)兩次，凝集素的凝集效價降低一個單位，最低效價濃度增大到0.39mg/mL?？赡茉蚴窃谳^高壓力的作用下，由于增加循環(huán)次數(shù)即延長了均質(zhì)作用時間，對凝集素分子結(jié)構(gòu)的解離和聚合有一定影響，從而使其凝集活性降低，具體變化機(jī)理還有待進(jìn)一步研究[14]。

3 結(jié)論

3.1 采用將蕓豆先勻漿后浸提工藝提取效果更佳，其凝集素粗品得率與將蕓豆先磨粉后浸提工藝所得到的凝集素粗品得率相近（平均略低1%），但是其血凝活性更強(qiáng)（血凝效價平均高出1倍），另外，中山產(chǎn)紅蕓豆凝集素粗品得率最高且血凝活性最強(qiáng)。

3.2 在一定范圍內(nèi)，超聲可顯著增強(qiáng)蕓豆凝集素粗品的得率和血凝活性。在本實驗條件下，在料液比1∶15、超聲功率325W、超聲時間20min對蕓豆凝集素影響最大，此時凝集素粗品得率最大，血凝效果最強(qiáng)。

3.3 普通均質(zhì)作用下不能顯著改變蕓豆凝集素粗品的得率，但是在大于40MPa的均質(zhì)壓力下循環(huán)作用兩次對凝集素的血凝效果有一定的破壞作用，凝集效價降低一個單位。

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Effect of ultrasonic probe and homogenization on crude phytohemagglutinin（PHA）from kidney bean

LIU Cen-cen，REN Jiao-yan*，ZHAO Mou-ming
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

Crude phytohemagglutinin（PHA）from four kinds of kidney bean was extracted by different processes. Besides，the effects of three factors（the ratio of solid to liquid，ultrasonic time and ultrasonic power）of ultrasonic processing and two factors（the pressure and circle time）of homogenization on crude PHA were studied as well.It was found the crude PHA extracted from red kidney bean produced at Zhongshan had the strongest hemagglutination activities and the highest yield among four kinds of kidney bean.Ultrasonic treatment could improve the yield and the hemagglutination activities of crude PHA in a certain range，which reaching the maximum at the ratio of solid to liquid 1∶15，the ultrasonic power 325W and the ultrasonic time 20min.Homogenization followed by extraction had little effect on crude PHA yield，while the hemagglutination activities decreased after the second circle when the pressure was higher than 40MPa.

phytohemagglutinin；ultrasonic probe；homogenization；yield；hemagglutination

TS214.9

A

1002-0306（2012）01-0115-04

2011－01－04 *通訊聯(lián)系人

劉岑岑（1988-），女，碩士研究生，主要從事食品生物技術(shù)的研究。

國家自然科學(xué)基金項目（31000759）；華南理工大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助（2009ZM0152）；華南理工大學(xué)自然科學(xué)基金（x2qsE5090560）。