溫度對酸乳中乳酸菌胞外多糖作用機制的研究

楊同香，王 芳，李全陽

（廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004）

溫度對酸乳中乳酸菌胞外多糖作用機制的研究

楊同香，王 芳，李全陽*

（廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004）

重點探討了不同發(fā)酵溫度下酸乳發(fā)酵產生的胞外多糖含量變化以及添加不同來源的胞外多糖對酸乳流變學特性的作用，結果表明：37℃條件下發(fā)酵所得酸乳多糖含量最高，達到461.4mg/mL，43℃條件下酸乳多糖含量最低，僅為247.6mg/mL。酸乳產生的內源性胞外多糖表現(xiàn)在產品特性上，其表觀黏度及剪切應力隨時間的變化都明顯（P＜0.05）高于外源添加胞外多糖的酸乳。表觀黏度隨剪切時間的變化曲線符合對數(shù)函數(shù)y=kLn（x）+b（內、外源R2分別為0.9527、0.9015）的變化規(guī)律。此外，酸乳經過發(fā)酵產生內源性胞外多糖后，其持水力（WHC）較添加外源性胞外多糖的酸乳高出26%，膠體脫水收縮作用敏感性（STS）較添加外源性胞外多糖的酸乳低46%。這說明低溫有利于乳酸菌胞外多糖形成，且內源性胞外多糖酸乳的表觀黏度大、持水力高。

酸乳，發(fā)酵溫度，胞外多糖，流變學特性

酸乳制作過程中，有些乳酸菌菌株在發(fā)酵產酸的同時還產生粘性成分——胞外多糖。這些成分能夠對酸乳的黏度、粘彈性、凝聚性、結構和質地等產生顯著的影響[1]，因此引起許多學者和企業(yè)的極大興趣。Milena Corredig[2]等對乳酸菌胞外多糖與蛋白質相互作用進行了綜述；Maude Girard[3]等采用滴定法和離心法研究了五種帶陰離子胞外多糖和牛奶蛋白質的相互作用；Ayala-Hernandez[4-5]等研究了乳酸乳球菌產胞外多糖與牛奶蛋白之間的相互作用，以及pH和中間產物對胞外多糖與牛乳蛋白相互作用和流變學特性的影響。這些研究者從不同的角度（如pH）揭示并闡釋了乳酸菌胞外多糖與蛋白質之間的相互作用，但未就溫度與乳酸菌胞外多糖的作用機理進行研究。孫健[6]研究了酸奶儲存溫度對其品質的影響；Lin[7]等研究了37℃發(fā)酵酸乳的發(fā)酵時間對乳酸菌胞外多糖含量的影響；馬艷[8]等研究了高產胞外多糖濕熱鏈球菌混菌的培養(yǎng)溫度對酸乳胞外多糖含量影響，由此看來，在各種影響因素中，溫度發(fā)揮著非常重要的作用。但是，目前均未發(fā)現(xiàn)針對發(fā)酵溫度對酸乳乳酸菌胞外多糖的作用機制的相關報道。因此，有必要對溫度與胞外多糖的影響作用機制進一步深入研究。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，酸乳在添加增稠劑后，其黏度反而下降，且有乳清析出現(xiàn)象[9]，隨后通過一系列實驗，探索并表征了現(xiàn)象背后的作用機制[10-12]，同時溫度對乳酸菌胞外多糖的產生具有非同尋常的影響作用，為此，本研究則著重探討溫度對乳酸菌胞外多糖產量的影響以及添加不同來源的胞外多糖對酸乳流變學特性的影響，以期豐富和深化乳酸菌胞外多糖的形成及其對酸乳特性的影響作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）、粘性嗜熱鏈球菌（Ropy streptococcus thermophilus） 由廣西大學輕工與食品工程學院保藏；牛奶 購自南寧市農大牛奶廠；脫脂奶粉 購自伊利實業(yè)集團股份有限公司；SephacrylS-300等 購自GE公司；無水乙醇、三氯乙酸、氫氧化鈉、乙醚、丙酮等 均為國產分析純。

高速離心機 Bekman公司；UV-1601紫外分光光度計 日本SHIMADZU公司；DV-Ⅲ流變儀 美國BROOK FIELD。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸乳制備工藝 農大牛奶→均質→殺菌→冷卻→接種→發(fā)酵→冷藏→后熟

所用的菌種為嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的混合菌種（1∶1），接種量為3%接種后分裝，分別在37、40、43℃條件下發(fā)酵，當酸度達到80°T時取出，放入4℃的冰箱中后熟24h。

1.2.2 內源性胞外多糖（EPS）的制備 內源性胞外多糖由粘性保加利亞菌株發(fā)酵復原脫脂乳制成。

1.2.3 外源性胞外多糖（EPS）的制備 普通保加利亞菌株發(fā)酵酸乳→鈍化→蒸發(fā)濃縮→乙醇沉淀→水溶解沉淀→加三氯乙酸去蛋白→透析→濃縮→乙醇沉淀→脫水→粗胞外多糖

將從不同溫度下發(fā)酵酸乳得到的粗胞外多糖樣品溶于0.05mol/L，pH7.5的磷酸鹽緩沖溶液中，用SephacrylS-300凝膠柱層析，0.05mol/L pH7.5的磷酸鹽緩沖溶液洗脫，胞外多糖的含量測定采用苯酚-硫酸法。

1.2.4 膠體脫水收縮作用敏感性（STS）的測定 在4℃下，將含內源性EPS、外源性EPS的發(fā)酵酸乳50g置入帶有120目不銹鋼絲網(wǎng)的漏斗中，用燒杯收集瀝出的乳清[13]。收集時間為2h，每個樣品取3個平行。

STS（%）=（乳清析出量/樣品質量）×100%

1.2.5 持水力（WHC）的測定 在10℃下，將含內源性EPS、外源性EPS的發(fā)酵酸乳15g放入離心管中，3000r/min離心30min[14]。每個樣品取3個平行。

WHC（%）=（離心后沉淀的質量/樣品質量）×100%

1.2.6 黏度的測定[15]采用DV-Ⅲ流變儀，測定條件：轉子轉速為0～224r/min，先升速后降速，時間間隔為8s。

1.2.7 觸變環(huán)的測定 采用DV-Ⅲ流變儀，測定條件：轉子轉速為0～224r/min，先升速后降速，升速/降速的頻率為16r/min，時間間隔為8s。

2 結果與討論

2.1 不同發(fā)酵溫度下多糖含量變化

酸乳胞外多糖經分離純化后得到的多糖含量曲線如圖1。

圖1 不同溫度下多糖含量曲線Fig.1 Content of exopolysaccharides at different fermented temperature

由圖1可知，在酸乳發(fā)酵溫度不同的條件下，37℃發(fā)酵酸乳多糖含量最高，達到461.4mg/L；40℃發(fā)酵酸乳多糖含量次之，為345mg/L；43℃發(fā)酵酸乳多糖含量最低，為247.6mg/L。Saija N[16]等指出胞外多糖產量與產糖菌株生長環(huán)境pH、溫度及蛋白含量組分有關。由于SephacrylS-300凝膠柱層析是根據(jù)分子篩效應對多糖進行等級分離純化的，所以，從圖1可以看出，不同溫度下的多糖，不僅含量不一樣（峰的高度），而且分子量分布也有很大不同（洗脫體積的差異），本實驗中大分子的多糖含量較高，小分子的多糖含量相對較低。而對多糖而言，分子量越大，其產生的粘度就越大。由此可以推測，在本實驗測定范圍內，低溫（37℃）發(fā)酵酸乳產的多糖分子量大，且其粘度高；而高溫（43℃）的多糖分子量相對較小，其粘度也相對較低。魏淑珍[17]等對一株嗜熱鏈球菌產胞外多糖的工藝進行了優(yōu)化，經過不同培養(yǎng)溫度的MRS培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后得出，39℃為其最適發(fā)酵溫度，多糖產量為844mg/mL。不同菌種發(fā)酵培養(yǎng)產胞外多糖的含量也不盡相同[18]，造成這一現(xiàn)象的原因可能主要是因為培養(yǎng)溫度的不同以及菌株產胞外多糖種類之間存在的差異，從而使其胞外多糖合成含量不同。

2.2 添加不同來源EPS酸乳的黏度和剪切應力

添加不同來源EPS酸乳的黏度和剪切應力隨時間變化的測定結果如圖2、圖3。

利用流變儀分別測定含內源性EPS、外源性EPS酸乳的黏度，結果表明：酸乳黏度隨轉速的變化趨勢相同（圖2），酸乳黏度隨轉速的上升，先急速上升，有一個極大值，然后又下降，最終趨于平緩；在降速測定時，相同轉速條件下，測得結果要比升速測定的結果小，說明有剪切稀釋現(xiàn)象。但從實驗結果可以很明顯地看出，含內源性EPS酸乳的黏度要遠高于外加內源性EPS酸乳的粘度。在胞外多糖與酪蛋白存在相斥作用的情況下，隨著乳酸菌胞外多糖含量的增加，多糖所形成的網(wǎng)孔會越來越小，此時形成的酪蛋白膠凝顆粒也會變得越來越小，因而會使其表觀黏度降低[10]。

由圖3可以看出，添加不同來源EPS酸乳的剪切應力都形成了觸變環(huán)，說明它們都是觸變體系。觸變環(huán)的面積反映了觸變性的大小。同時，從圖3可以明顯看出內源性EPS發(fā)酵酸乳的觸變環(huán)面積較外源性EPS酸乳的大，說明含有內源性EPS的酸乳經外力作用后，其應力變化較外源性EPS酸乳的大，外力撤出后，此體系回復到未經外力作用的體系狀態(tài)所需的時間也更長。這與趙正濤[10]、Janaina[19]等的報道結果趨勢類似，但較本實驗中剪切應力值小，這可能主要是因為增稠劑的種類不同及其添加量影響酸乳的黏度及剪切應力。

圖2 添加不同來源EPS酸乳的黏度Fig.2 Viscosity of yogurt with different addition of exopolysaccharides

圖3 不同來源EPS的酸乳樣品在變速剪切下的剪切應力的變化Fig.3 Variable speed controlled shearing against shearing stress of yogurt with exopolysaccharides from different sources

2.3 EPS不同添加方式下酸乳表觀黏度隨時間變化

圖4 不同添加方式下酸乳樣品表觀黏度隨時間變化Fig.4 The apparent viscosity of yogurt with exopolysaccharides from different sources changes with time

添加不同來源EPS酸乳的表觀粘度隨時間變化如圖4。

由圖4可以看出，在相同發(fā)酵溫度、相同菌種接種量、相同終點發(fā)酵酸度的酸乳樣品，添加不同來源EPS，經在恒溫、恒速的剪切作用下，其表觀黏度都逐漸減小，并且較好地遵循對數(shù)曲線方程。內源性EPS對其線性回歸得方程為y內=-69.7ln（x）+350.8，其相關系數(shù)為0.9527；外源性EPS對其線性回歸得方程為y外=-128.9ln（x）+633.75，其相關系數(shù)為0.9015。其中，內源性EPS酸乳的表觀黏度要明顯高于外源性EPS酸乳的表觀黏度，但隨著剪切時間的推移，二者基本持平。這可能主要是因為在內源的乳酸菌EPS漸進產生和逐步形成“網(wǎng)絡”的干擾下，酪蛋白絮凝形成的立體網(wǎng)狀結構才能連續(xù)而且細密。

我們認為外源的EPS會導致形成的酸乳凝膠連續(xù)性較差，酪蛋白在具有強大的空間位壘和排斥作用的EPS網(wǎng)絡提前形成的條件下，其絮凝在構建立體網(wǎng)狀結構時，只能形成細碎、不連續(xù)的結構，嚴重干擾了酸乳立體網(wǎng)狀結構的形成[20]，從而使其黏度下降。Girard M[3]等在研究五種胞外多糖與牛奶蛋白的相互作用時，指出在pH5.4和6.1時，胞外多糖含量的增加，酪蛋白受到的影響較小，而對乳清蛋白影響較大，乳清蛋白跟乳酸菌胞外多糖黏附于一起。因而可以推斷，隨著酸乳凝膠的形成，pH的降低，酪蛋白逐漸達到其等電點，發(fā)生變性，使其黏度逐漸變小，而pH的變化對乳清蛋白的影響較小。

2.4 EPS不同添加方式酸乳的STS和WHC

不同來源EPS制作的酸乳的STS值與WHC值如圖5。

圖5 EPS不同添加方式酸乳的STS和WHCFig.5 STS and WHC of yogurt addition with different exopolysaccharides

酸乳STS是酸乳凝膠對各種乳成分，尤其是水分的結合能力，這種結合力包括結合水凝膠立體網(wǎng)絡中自由的結合能力；酸乳WHC是指一定量的酸乳在一定的溫度、離心力、時間的作用下，酸乳凝膠對水分的結合能力。

圖5顯示，內源性EPS酸乳的WHC較外源性EPS酸乳的高出26%，STS較外源性EPS酸乳低46%。這說明內源性EPS的酸乳在規(guī)定的時間內失去的乳清最少，體系的大分子結合水的含量最高，穩(wěn)定性最好，而外源性EPS酸乳的STS值大，WHC值相對較小，說明其乳清析出最多，穩(wěn)定性也差。即直接添加粘性保加利亞菌株發(fā)酵復原脫脂乳制成的EPS，酸乳的穩(wěn)定性更好。

綜上所述，在溫度對酸乳中乳酸菌胞外多糖影響作用的機制研究方面，本研究發(fā)現(xiàn)：不同發(fā)酵溫度酸乳產胞外多糖含量不同，低溫更利于乳酸菌胞外多糖的形成。由于多糖分子通過靜電作用和自身形成的空間位壘作用影響酸乳網(wǎng)狀結構的形成，從而降低酪蛋白立體網(wǎng)狀結構的牢固程度。當高溫發(fā)酵酸乳時，其乳酸菌胞外多糖含量較低時，形成的網(wǎng)眼較大，酪蛋白凝集體過大，導致酸乳乳清析出嚴重。隨著酸乳發(fā)酵溫度的降低，其乳酸菌胞外多糖含量增加，多糖分子不僅本身吸收自由水分子的數(shù)量增加，而且本身產生的空間位壘效應不斷增強，導致酪蛋白凝集體變得細小，進一步減少了乳清析出，從而表現(xiàn)為酸乳的表觀黏度和剪切應力下降。酸乳產生的內源性胞外多糖隨發(fā)酵時間的延長而增多，其體系中的分子相互作用是逐步緩慢進行的。但外源性胞外多糖酸乳體系的多糖含量一定，在發(fā)酵過程中多糖含量慢慢降低。由于一開始多糖含量較高，使其與原料乳中蛋白等充分作用。但隨著發(fā)酵時間的延長，酸乳體系中多糖含量減少，使多糖分子與蛋白之間的相互作用減弱。這表現(xiàn)在產品特性上，內源性EPS酸乳的乳清析出較少，穩(wěn)定性高。

3 結論

3.1 酸乳乳酸菌胞外多糖產量隨溫度的變化而不同，37℃發(fā)酵酸乳多糖含量遠高于40、43℃發(fā)酵酸乳，達到最高值，多糖含量為461.4mg/mL，43℃發(fā)酵酸乳多糖含量最低，為247.6mg/mL。說明在本實驗溫度測定范圍內，低溫有利于乳酸菌胞外多糖的形成。

3.2 酸乳產生的內源性胞外多糖表現(xiàn)在產品特性上，其表觀黏度及剪切應力隨時間的變化都明顯高于添加外源性胞外多糖的酸乳，且都較好地遵循對數(shù)曲線方程，表明內源性EPS制成的酸乳其粘彈性更好。

3.3 內源性EPS酸乳的WHC要高于外源性EPS酸乳的，即表明直接添加粘性保加利亞菌株發(fā)酵復原脫脂乳制成的EPS，酸乳的乳清析出較少，穩(wěn)定性更好。

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Effect mechanism of fermentation temperature on the characteristics of bacteria exopolysaccharides in yogurt

YANG Tong-xiang，WANG Fang，LI Quan-yang*
（College of Light Industry and Food Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，China）

The changes of extracellular polysaccharides content at the different fermentation temperature of yoghurt and the effects of different sources of extracellular polysaccharides on the rheology properties of yogurt were studied.The result showed：the content of exopolysaccharides was highest（247.6mg/mL）in yogurt fermented at 37℃，whereas，it was the lowest，only 247.6mg/mL，at 43℃.The apparent viscosity and shear stress of samples changing against time were obviously（P＜0.05）higher than that of adding exogenous exopolysaccharide.The regression curves of apparent viscosity against shear time were found to conform to a logarithmic function，y=kLn（x）+b.In addition，water holding capacity（WHC）of yogurt with endogenous exopolysaccharide was 26%higher than that of adding exogenous exopolysaccharide.Susceptibility to syneresis（STS）of yogurt with endogenous exopolysaccharide was 46%lower than adding exogenous exopolysaccharide. It showed temperature was favorable for lactic acid bacteria exopolysaccharides formation，and the yoghurt with endogenous extracellular polysaccharide showed a higher viscosity and water holding capacity.

yogurt；fermentation temperature；exopolysaccharide；rheological characteristics

TS252.1

A

1002-0306（2012）09-0058-04

2011－08－02 *通訊聯(lián)系人

楊同香（1983-），女，博士研究生，研究方向：生物大分子與功能性食品。

國家自然科學基金項目（31071576）；廣西大學人才資助項目（XZL090325）。