擬南芥角果角度相關(guān)基因SPA的分子鑒定與功能分析

張盛春， 陽成偉

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室,廣東廣州 510631)

擬南芥角果角度相關(guān)基因SPA的分子鑒定與功能分析

張盛春， 陽成偉*

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室,廣東廣州 510631)

利用T-DNA插入突變的方法從擬南芥中篩選得到1個角果果柄生長角度變小的突變體，克隆得到該突變基因為SPA基因，并利用PCR和RT-PCR方法驗證了T-DNA的插入位點；將SPA基因轉(zhuǎn)入spa突變體后，互補植株角果角度恢復(fù)到野生型水平．推測SPA基因可能在調(diào)控角果角度方面具有重要功能．

擬南芥； 角果角度；SPA基因； TAIL-PCR

角果是來自于植物莖尖分生組織的一種側(cè)生器官[1]．花?；蛘呓枪c花序軸莖之間的角度對植物花序的形態(tài)特征至關(guān)重要，不僅能影響觀賞植物的美觀，更有可能影響植物的產(chǎn)量[2]．

目前在模式植物擬南芥中已有一些與花梗發(fā)育的相關(guān)基因被分離鑒定，比如說POL和PLL1基因通過與ERECTA基因相互作用調(diào)控花柄的長度[3]；AtEXP10介導(dǎo)花梗的離層形成[4]；AtMYB13基因能夠使花梗末端形成彎鉤[5]．但是對于調(diào)控果柄角度基因的分離和鑒定非常少．KNAT1基因缺失突變后產(chǎn)生向下生長的角果[6]．生長素信號突變體axr6的角果與花序軸的夾角為明顯的銳角[7]． 一般情況下，野生型角果與花莖之間的角度約為60°，擬南芥G蛋白ROP2基因過量表達則能達到90°或者90°以上，而抑制突變體則全部要小于60°[8]．肌動蛋白絲成束蛋白基因VILLIN2和VILLIN3雙突變體vln2vln3的角果角度變小[9]．側(cè)生器官邊界基因BOP1和BOP2蛋白通過LBD來調(diào)控角果角度，BOP1和BOP2過量表達植株的角果向下生長[10]，而bop1bop2雙突變體的角果則直立向上生長，與花序軸莖的夾角明顯小于野生型的[11]．蕓薹屬植物與擬南芥同屬十字花科，目前對有關(guān)蕓薹屬植物如油菜的基因組的了解還不清楚，因此擬南芥的分子生物學(xué)研究對蕓薹屬作物的應(yīng)用基礎(chǔ)研究至關(guān)重要．

作者在研究前期以農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物表達載體pCAMBIA1300轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，利用T-DNA插入突變體的方法構(gòu)建了擬南芥突變體庫．在該突變體庫中作者發(fā)現(xiàn)了1個花柄/果柄與花序軸夾角變小的突變體spa，相對應(yīng)的基因被命名為SPA(Small Pedicel Angle,SPA)．本論文利用分子生物學(xué)方法分離鑒定SPA,并對其功能進行了驗證，為從模式植物擬南芥中發(fā)掘角果角度相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)，為作物改良提供基因資源具有重要意義．

1 材料與方法

1.1植物材料

擬南芥(ArabidopsisthalianaL.) 為Columbia-0生態(tài)型，SPA基因號為At2g26140． 種子先用體積分數(shù)為70%乙醇溶液表面消毒30 s后，加入質(zhì)量分數(shù)為10% 次氯酸鈉消毒10 min，無菌水沖洗4～5次后均勻鋪種于MS平板．4 ℃保濕黑暗冷藏3 d.打破休眠后，移至培養(yǎng)房中培養(yǎng)，10 d后移至土壤中生長，培養(yǎng)溫度為22±2 ℃, 光暗周期為16 h光照/8 h黑暗，光照強度為120～150 μmol/(m2·s)．

1.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

采用改造過的植物表達載體pCAMBIA1390，利用引物5′- AGTTCTAGAATGGCTTGGAGGCGCATC-3′和5′- ACTGGATCCTTACGATACTGGCGCCATGTC-3′,把SPA基因的CDS連接到T載體克隆后，測序正確的基因片段利用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切后，與相同酶切后的植物表達載體連接．以pCAMBIA1390質(zhì)粒為對照，連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，采用花粉管浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥，潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因植株并用PCR進行檢測，單位點插入的純合轉(zhuǎn)基因株系用于后續(xù)實驗．

1.3半定量RT-PCR

利用TRIzol試劑 (Invitrogen)提取總RNA后，用DNAaseⅠ(Takara) 處理以消除基因組DNA的污染．定量后取等量的RNA利用PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)進行cDNA第一鏈合成，再取等量的cDNA為模板進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)26個循環(huán)，取15 μL PCR產(chǎn)物電泳檢測．

檢測目的基因SPA的引物為5′- AGTTACTGGAGCTGTGGGTGGTG -3′和5′- TTTGCCAATTCCTCTGTCCTCG-3′；內(nèi)參Actin基因的引物為5′ -GTATGTGGCTATTCAGGCTGT-3′和5′ -CTGGCGGTGCTTCTTCTCTG-3′．

1.4 Tail-PCR及PCR驗證

擬南芥基因組DNA用經(jīng)典的CTAB 法提取.利用劉耀光等[12]所使用的TAIL-PCR方法克隆突變體T-DNA 插入?yún)^(qū)側(cè)翼序列，所使用的特異引物序列、隨即引物序列以及PCR的反應(yīng)程序均與文獻中的一致．

PCR驗證時在T-DNA上所選用的特異序列為左邊界引(LB):5′-ATCCAGTACTAAAATCCAGATCCCCCG-3′，在插入位點左邊側(cè)翼序列即左邊基因組序列上所設(shè)選的基因組引物為左側(cè)基因組引物 (LG)， 在插入位點右邊側(cè)翼序列即右邊基因組序列上所設(shè)選的基因組引物為右側(cè)基因組引物(RG)，分別將LB、LG、RG 3條引物進行兩兩組合，以野生型和突變體DNA為模板進行PCR反應(yīng)．

1.5 角果角度測定

采用量角器測量花梗/果柄與花序軸之間的角度，拍照并測定相關(guān)數(shù)據(jù)．每次對每種基因型植物測量32棵不同植株，測量每棵植株的所有角果，3次生物學(xué)重復(fù)．

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的表型分析

在野生型植株中，角果的生長角度一般呈60°左右，即為斜生型角果(圖1A)．在spa突變體中，除開花序軸最下面即最先長出的5個角果角度與野生型植株基本一致外，其它角果與花序軸之間的角度明顯變小，部分角果與花序軸平行，突變體角果與花序軸之間的夾角平均只有30°左右，呈典型的平生型角果(圖1B, C)．

α:角果與花序軸之間的夾角；Col：野生型植株；spa：突變體植株

2.2 突變體基因的鑒定

作者利用TAIL-PCR的方法尋找T-DNA在擬南芥基因組中的插入位點．通過設(shè)計T-DNA邊界特異引物以及兼并引物，2輪PCR反應(yīng)后得到了清晰的目的條帶(圖2A中第2條泳道中的產(chǎn)物),切膠回收后測序，得到的序列片段進行BLAST比對分析后發(fā)現(xiàn)目前片段中一部分為T-DNA序列，而另一部分為一個蛋白酶基因DNA的序列(即為SPA基因)．與T-DNA特異序列相連的DNA片段從SPA基因5′-UTR區(qū)域的前5個堿基開始，表明T-DNA插入在SPA基因的啟動子區(qū)域．

為了更進一步確定該T-DNA的確切插入位點，設(shè)計了T-DNA左邊界的特異引物(LB，Left Board)，以及可能插入位點兩側(cè)的基因組DNA引物．分別利用T-DNA的左邊界引物與左側(cè)基因組引物(LG，Left Genomic primer)、T-DNA的左邊界引物與右側(cè)基因組引物(RG，Right Genomic primer)以及左、右側(cè)基因組引物對野生型與突變體的基因組進行擴增．如果T-DNA確實插入在該位置的話，則在野生型植株中只有左、右側(cè)基因組引物能夠擴增出相應(yīng)大小的基因片段條帶；而在突變體中則T-DNA的左邊界引物與左側(cè)基因組引物能擴增出相應(yīng)的目的片段，但是由于T-DNA比較大，使左、右側(cè)基因組引物對以及T-DNA的左邊界引物與右側(cè)基因組引物均在突變體中擴增不出DNA片段．結(jié)果表明，野生型植株中確實只有左、右側(cè)基因組引物對能夠擴增出預(yù)期大小的目的片段(圖2B泳道3)，spa突變體除開左、右側(cè)基因組引物對外(圖2B泳道6)，另外2組引物均能擴增出預(yù)期大小的目的片段(圖2B泳道4和5)，說明spa突變體中T-DNA確實插入在SPA基因的啟動子區(qū)域，并且有2個相同的T-DNA反向串聯(lián)插入在該位置，從而導(dǎo)致T-DNA的左邊界引物與右側(cè)基因組引物也能夠在突變體中擴增出相應(yīng)的DNA片段．

在研究擬南芥功能基因過程中，T-DNA插入在基因上游啟動子調(diào)控區(qū)域時一般會導(dǎo)致基因表達量的降低或者增加．利用RT-PCR檢測了野生型和突變體中SPA基因的表達結(jié)果的表明,突變體中SPA基因的表達量相對于野生型植株明顯下調(diào)，只能檢測到非常微量的表達(圖2C)，相當于SPA基因的功能缺失突變體，說明spa突變體的表型可能是由于T-DNA插入到SPA基因啟動子區(qū)域?qū)е耂PA基因表達的下調(diào)所引起的．

圖2A中M為分子標準；1為第1輪TAIL-PCR產(chǎn)物；2為第2輪TAIL-PCR產(chǎn)物．圖2B中Col為野生型植株；spa為突變體植株；1和4為LB與LG引物對的產(chǎn)物；2和5為LB與RG引物對的產(chǎn)物；3和6為LG與RG引物對的產(chǎn)物．

2.3SPA基因表達

花梗/角果果柄與花序軸之間的角度變化這一表型與花序軸以及果柄的結(jié)構(gòu)和功能均有關(guān)，RT-PCR分析了SPA基因在相關(guān)組織器官表達．結(jié)果顯示，SPA基因在花序軸、果柄以及角果中的均有表達，表達量較高(圖3)，表明SPA基因的表達與功能具有明顯的相關(guān)性．

圖3 SPA基因表達

2.4 SPA基因的功能互補

利用SPA基因的CDS序列構(gòu)建好互補載體并轉(zhuǎn)化spa突變體植株，篩選純合后，對野生型、突變體以及互補轉(zhuǎn)基因植株(SPA-spa)中的SPA基因表達量進行了檢測，結(jié)果顯示在spa突變體的互補植株中，SPA基因的表達水平恢復(fù)到了野生型水平(圖4)，表明互補植株能夠用于下一步的表型分析．

Col：野生型植株；spa：spa突變體；SPA-spa：spa突變體互補植株

進一步對野生型植株、spa突變體以及互補植株的角果角度進行了統(tǒng)計分析．結(jié)果顯示SPA基因轉(zhuǎn)入到spa突變體后，能夠使突變體角果角度從原來的30°左右恢復(fù)到野生型的60°左右(表1)，表明spa突變體中角果與花序軸夾角變小的表型確實是由于SPA基因的表達缺失所引起的．

表1 SPA基因恢復(fù)spa突變體角果夾角大小Table 1 SPA gene rescues the silique angle of the spa mutant

3 討論

油菜在終花期以后，葉片枯萎脫落，主要靠綠色的角果進行光合作用，籽粒灌漿的干物質(zhì)有一半以上由角果皮制造提供[13]．因此，維持角果果皮的光合效率對提高粒數(shù)、粒重有重要的意義．角果的生長角度對其光能吸收具有重要影響，主要由果柄所決定．果柄由花柄發(fā)育而成，成熟時果柄與花序軸所成角度的大小以及角果在果柄上的生長狀態(tài)與產(chǎn)量密切相關(guān)．因此，擬南芥角果生長角度相關(guān)基因SPA的發(fā)現(xiàn)與鑒定對蕓薹屬作物如油菜的產(chǎn)量具有重要意義，能夠為培育理想角果角度的油菜品種提供分子基礎(chǔ)．

目前調(diào)控擬南芥角果與花序軸角度基因分離鑒定還較少，相關(guān)的機理研究還不夠深入．已有的研究主要集中在KNOX(knotted-like homeobox)基因KNAT1對角果調(diào)控中的功能．擬南芥中KNOX基因家族分為2大類，其中STM，KNAT1，KNAT2以及KNAT6屬于第一類．KNAT1在調(diào)控花序軸發(fā)育過程中起重要作用，其同源基因BREVIPEDICELLUS(BP)基因的突變體bp-1和bp-2的花梗以及角果均向下生長，主要是由于花梗遠軸面表皮細胞和周皮細胞的細胞分化、伸長以及細胞數(shù)目受到嚴重的抑制，而近軸面得細胞則基本正常生長，因此導(dǎo)致了花梗兩側(cè)的不對稱生長，從而使花梗生長方向向下[6]．BOP1和BOP2在bp突變體中失去作用后能夠恢復(fù)bp突變體角果向下生長的表型，bop1bop2bp-1三突變體的角果角度與野生型植株的基本一致，表明BP基因通過BOP1和BOP2的作用來調(diào)控花梗的角度[11]．同樣，在bp突變體中敲除KNAT6基因后即bpknat6雙突變體能夠部分恢復(fù)bp突變體角果的角度，而同時敲除KNAT6和KNAT2后，bpknat2knat6突變體的角果角度能夠完全恢復(fù)到野生型的大小，表明KNAT2和KNAT6在BP基因的下游起作用[14]．另外，knat6功能缺失突變體能夠恢復(fù)BOP2基因過量表達植株角果角度向下生長的表型，表明BOP1和BOP2基因是通過KNAT6基因起作用[11]．因此目前擬南芥中調(diào)控角果果柄/花梗與花序軸主莖之間角度的分子生物學(xué)通路BREVIPEDICELLUS(BP)-BOP1/BOP2-KNAT6一條串聯(lián)途徑比較清楚，這條發(fā)育途徑受到其他調(diào)控基因的調(diào)節(jié)未見報道．BOP2基因還能夠促進木質(zhì)素的形成，從而使花序軸以及花梗中的細胞分化提前，影響了次生壁的形成，從而導(dǎo)致了過量表達植株角果果柄的支撐力不夠從而往下垂[11]，而BP基因在調(diào)控木質(zhì)素形成過程中的功能與BOP2基因相反[15]．

本文鑒定得到的SPA基因是一個新的調(diào)控角果生長角度的基因，通過功能互補實驗驗證了SPA基因的功能缺失對角果生長具有重要作用，后續(xù)研究將研究spa突變體花梗/果柄的木質(zhì)素合成是否受到影響，以及其近軸面、遠軸面的表皮細胞和周皮細胞的分裂、伸長以及分化是否受到影響，從細胞生物學(xué)角度探究spa突變體中角果角度變小的細胞生物學(xué)機制．另外，研究已知的與角果角度相關(guān)的基因如BP、BOP1、BOP2等在spa突變體中的表達，并把spa與角果角度相關(guān)突變體如bp、bop1、bop2等進行雜交，從分子生物學(xué)角度和遺傳學(xué)角度為闡明SPA基因調(diào)控角果角度的機制提供證據(jù)．

[1] DOUGLAS S J, RIGGS C D. Pedicel development in Arabidopsis thaliana: Contribution of vascular positioning and the role of the BREVIPEDICELLUS and ERECTA genes[J]. Dev Biol, 2005, 284：451-463.

[2] WANG Y, LI J. Molecular basis of plant architecture[J]. Annu Rev Plant Biol, 2008, 59: 253-279.

[3] SONG S K, CLARK S E. POL and related phosphatases are dosage-sensitive regulators of meristem and organ development in Arabidopsis[J]. Dev Biol, 2005, 285: 272-284.

[4] CHO H T, COSGROVE D J. Altered expression of expansin modulates leaf growth and pedicel abscission in Arabidopsis thaliana[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97: 9783-9788.

[5] KIRIK V, KOLLE K, WOHLFARTH T, et al. Ectopic expression of a novel MYB gene modifies the architecture of the Arabidopsis inflorescence[J]. Plant J, 1998, 13: 729-742.

[6] VENGLAT S P, DUMONCEAUX T, ROZWADOWSKI K, et al. The homeobox gene BREVIPEDICELLUS is a key regulator of inflorescence architecture in Arabidopsis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99: 4730-4735.

[7] HOBBIE L, MCGOVERN M, HURWITZ L R, et al. The axr6 mutants of Arabidopsis thaliana define a gene involved in auxin response and early development[J]. Development, 2000, 127: 23-32.

[8] LI H, SHEN J J, ZHENG Z L et al. The Rop GTPase switch controls multiple developmental processes in Arabidopsis[J]. Plant Physiol, 2001, 126: 670-684.

[9] VAN DER HONING H S, KIEFT H, EMONS A M, et al. Arabidopsis VILLIN2 and VILLIN3 are required for the generation of thick actin filament bundles and for directional organ growth[J]. Plant Physiol, 2012, 158: 1426-1438.

[10] HA C M, JUN J H, NAM H G, et al. BLADE-ON-PETIOLE 1 and 2 control Arabidopsis lateral organ fate through regulation of LOB domain and adaxial-abaxial polarity genes[J]. Plant Cell, 2007, 19: 1809-1825.

[11] KHAN M, XU M, MURMU J, et al. Antagonistic interaction of BLADE-ON-PETIOLE1 and 2 with BREVIPEDICELLUS and PENNYWISE regulates Arabidopsis inflorescence architecture[J]. Plant Physiol, 2012,158: 946-960.

[12] LIU Y G, CHEN Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences[J]. Biotechniques, 2007, 43: 649-650, 652, 654.

[13] LENG S H, ZHU G R, DENG X L.Studies on the sources of the dry matter in the seed of rapeseed[J]. Acta Agron Sin, 1992, 18: 250-257.

[14] RAGNI L, BELLES-BOIX E, GUNL M, et al. Interaction of KNAT6 and KNAT2 with BREVIPEDICELLUS and PENNYWISE in Arabidopsis inflorescences[J]. Plant Cell, 2008, 20: 888-900.

[15] MELE G, ORI N, SATO Y, et al. The knotted1-like homeobox gene BREVIPEDICELLUS regulates cell differentiation by modulating metabolic pathways[J]. Genes Dev, 2003, 17: 2088-2093.

IdentificationandFunctionAnalysisoftheSiliqueAngleGeneSPAinArabidopsis

ZHANG Shengchun, YANG Chengwei*
(Guangdong Provincial Key Lab of Biotechnology for Plant Development, College of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

A decreased silique pedicel angle mutant was obtained by the T-DNA insertion method inArabidopsis(Arabidopsisthaliana). The mutantSPAgene was cloned using the TAIL-PCR method, and the insertion site was verified by the PCR and RT-PCR. After transformed with theSPAgene, the silique angle of thespamutant can be rescued to the size of the wild type plants. These results suggest thatSPAmay play important roles in regulating plant silique angle.

2012-03-20

國家自然科學(xué)基金項目(30900789)

*通訊作者，yangchw@scnu.edu.cn

1000-5463(2012)03-0107-05

J653

A

10.6054/j.jscnun.2012.06.023

Keywords：Arabidopsisthaliana; silique angle;SPAgene; TAIL-PCR

【責任編輯 成 文】