HPLC法測(cè)定創(chuàng)傷愈合藥噴霧劑中血竭素的含量

陳振振，張靈英，李 莉，殷中瓊，張 強(qiáng)，李 開

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川雅安 625014;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命理學(xué)院，四川雅安 625014)

血竭、乳香、沒藥等為中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中治療皮膚瘡瘍和創(chuàng)傷的常用藥，常單用或配伍用，其臨床療效已被肯定［1-2］，《本草綱目》記載這些藥物具有收斂止血、活血化瘀、消腫止痛、解毒斂瘡、祛腐與潤(rùn)膚生肌等作用。《大明本草》記載“治一切惡瘡疥癬久不合者”，故血竭為最常用的生肌之藥，諸家生肌方均不離此藥［3-4］。乳香和沒藥常配伍使用，但乳香以活血散腫止痛為主，而沒藥以消腫止痛生肌為主［3］?，F(xiàn)代藥理研究表明油樟葉揮發(fā)油具有抗菌、鎮(zhèn)痛和抗炎作用［5］。為了研制對(duì)皮膚創(chuàng)傷具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛和收斂止血及祛腐與潤(rùn)膚生肌作用的外用藥物，在實(shí)驗(yàn)室前期研究中將血竭素、乳香揮發(fā)油、沒藥揮發(fā)油、油樟葉揮發(fā)油幾味具有上述功效的藥物組成復(fù)方，制備成創(chuàng)傷愈合藥噴霧劑［6］，臨床上擬用于治療動(dòng)物的皮膚創(chuàng)傷、潰爛、感染等疾病。處方中血竭素的含量為其重要控制指標(biāo)之一，據(jù)報(bào)道血竭素的含量測(cè)定方法有薄層掃描法［7］、高效液相色譜法［8-9］。為了控制該噴霧劑的質(zhì)量，保證臨床療效，本試驗(yàn)采用HPLC法對(duì)制劑中的主要活性成分之一血竭素進(jìn)行含量測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 島津 SH MADZU LC-2010C HT(CLASS-VP 6.13 multi)高效液相色譜儀(島津國(guó)際貿(mào)易上海有限公司);JD100-3電子分析天平(沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司);雙頻數(shù)顯臺(tái)式清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司);SZ-BⅢ型三重純水蒸餾器(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.1.2 藥物與試劑 血竭素高氯酸鹽對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110811-200704);創(chuàng)傷愈合藥噴霧劑(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系自制，批號(hào) 120308、120309、120310、120311、120312、120313);實(shí)驗(yàn)用甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純;水為三重蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為 Kromasil C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);乙腈 -0.05 mol/L 磷酸二氫鈉溶液(50∶50)(用磷酸調(diào)pH為3.5)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)440 nm，柱溫40℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。理論板數(shù)按血竭素計(jì)算不得低于4000。

1.2.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取血竭素標(biāo)準(zhǔn)品(高氯酸鹽血竭素)9.0 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加入3%磷酸甲醇溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻得濃度為0.1307 mg/mL(以血竭素計(jì)算)的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述溶液2 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得每毫升中含血竭素26.14 μg(血竭素重量=血竭素高氯酸鹽重/1.377)。

供試品溶液的制備：精密量取創(chuàng)傷愈合藥噴霧劑1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻后即得供試品溶液，貼標(biāo)簽放置備用。

陰性對(duì)照溶液的制備：取只含輔料的空白噴霧

劑作為陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

1.2.3 線性關(guān)系的考察 精密吸取制備好的對(duì)照品(13.07、19.61、26.14、32.68、39.21、45.74 μg/mL)分別進(jìn)樣 20 μL，依法測(cè)定，記錄峰面積(S，以血竭素峰計(jì)，以下相同)。以濃度(C，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(S)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

1.2.4 精密度試驗(yàn) 精密量取同一血竭素對(duì)照品溶液20 μL(26.14 μg/mL)，在 1.2.1 項(xiàng)中的色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄血竭素峰面積，考察儀器精密度。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在1.2.1項(xiàng)中的色譜條件下，精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 20 μL，于 0、2、4、8、16、24 h各進(jìn)一次樣，進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 空白試驗(yàn) 按處方比例和工藝，制成不含血竭素的空白創(chuàng)傷愈合藥噴霧劑，精密量取1.0 mL空白溶液，置入10 mL容量瓶中，在1.2.1項(xiàng)中的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3次。

1.2.7 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的不同批樣品(批號(hào) 120308、120309、120310、120311、120312 和120313，含血竭素分別為 0.0192、0.0188、0.0191、0.0188、0.0192、0.0190 mg/mL)6 份，精密量取 1.0 mL，分別置于6個(gè)10 mL棕色容量瓶中，分別加入精密量取的2×10-2mg/mL血竭素高氯酸鹽甲醇溶液1.0 mL，用甲醇定容。將此6份溶液在1.2.1項(xiàng)中的色譜條件下測(cè)定，測(cè)定各峰面積后帶入回歸方程分析。

1.2.8 樣品含量的測(cè)定 精密吸取制備好的6份供試品溶液20 μL，分別進(jìn)樣，每份重復(fù)測(cè)定3次，取平均值為噴霧劑中血竭素的含量。

2 結(jié)果

2.1 方法的專屬性研究 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各20 μL，在1.2.1項(xiàng)中的色譜條件下，供試品中血竭素色譜峰與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致，并與雜質(zhì)峰分離度大于1.5，且陰性樣品在相應(yīng)的位置上無(wú)色譜峰干擾(圖1～圖3)。

2.2 線性關(guān)系的考察 線性關(guān)系考察結(jié)果得回歸方程為：Y=6 × 107X-1.5 × 105，r=0.9997(n=6)。結(jié)果表明血竭素濃度在 13.07 ～45.74 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一血竭素對(duì)照品溶液20 μL，在1.2.1項(xiàng)中的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，血竭素平均峰面積值為 2276094，RSD為0.76%(n=6)。結(jié)果表明重復(fù)性良好，儀器精密度符合要求。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在1.2.1項(xiàng)中的色譜條件下，精密吸取對(duì)照品溶液，分別于 0、2、4、8、16、24 h 進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，在24 h內(nèi)血竭素的平均峰面積值為2275864，RSD 為0.48%(n=6)，表明試驗(yàn)穩(wěn)定性良好。

2.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的不同批樣品(批號(hào) 120308、120309、120310、120311、120312 和120313，含血竭素分別為 0.0192、0.0188、0.0191、0.0188 、0.0192、0.0190 mg/mL)6 份，精密量取1.0 mL，分別加入精密量取2×10-2mg/mL血竭素高氯酸鹽甲醇溶液1.0 mL，按供試品溶液的制備方法操作，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定其峰面積并計(jì)算加樣回收率，平均回收率為98.29%，RSD為0.67%(n=6)(表1)。

2.6 樣品含量測(cè)定 取不同批次樣品各2份，按供試品溶液制備方法制備，分別進(jìn)樣20 μL，每次重復(fù)測(cè)定3次，測(cè)得噴霧劑中血竭素的平均含量為0.01902 mg/mL(表2)

3 討論

血竭素為色原酮類化合物，性質(zhì)不穩(wěn)定，見光易分解，在操作過(guò)程中應(yīng)盡量避免強(qiáng)光直射，并用3%磷酸甲醇作為溶劑，使樣品中的血竭素轉(zhuǎn)變?yōu)檠咚氐牧姿猁}，增強(qiáng)其穩(wěn)定性。HPLC法測(cè)定血竭素的含量應(yīng)注意色譜柱條件，保證柱溫。一般來(lái)說(shuō)柱溫升高會(huì)降低柱壓，樣品的保留時(shí)間會(huì)提前;柱溫不恒定，對(duì)樣品峰寬的影響比較明顯。

表1 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=6) mg/mL

本研究按照《中國(guó)藥典》中規(guī)定的方法進(jìn)行操作，使用乙腈∶0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(50∶50)作為流動(dòng)相時(shí)能夠?qū)⒀咚嘏c雜質(zhì)峰完全分離，且峰形好、柱效高。研究所確定的創(chuàng)傷愈合藥噴霧劑中血竭素含量的測(cè)定方法，具有結(jié)果準(zhǔn)確可靠、方法簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，可以作為噴霧劑質(zhì)量控制的依據(jù)之一。

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