芒果皮提取物的體外清除自由基作用研究＊

周榮光，楊兆祥，王 金，何凌宇，普俊學(xué)

（1.昆明制藥集團(tuán)股份有限公司藥物研究院，云南 昆明650100；2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650224；3.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南 昆明650500）

芒果系漆樹科芒果屬植物芒果（Mangif er a indical L.）的成熟果實(shí)，主產(chǎn)于熱帶、亞熱帶，是世界第二大熱帶水果，被譽(yù)為“熱帶水果之王”。在我國，芒果主要分布在云南（東南部）、貴州（南部）和廣西（南部）三省，多為家養(yǎng)栽培，為當(dāng)?shù)氐闹匾?jīng)濟(jì)作物。研究表明，芒果果皮含有大量的黃酮［1］、山酮［1］、多糖［2］以及種類眾多的小分子多酚類物質(zhì)［3］，具有止咳化痰［4］、抗炎［4］、抑 菌［5］、抗 氧 化［6］等 作 用。目 前，芒 果 除 鮮 食外，主要被加工成飲料、罐頭、果凍等，加工過程中產(chǎn)生的約占鮮果重量5%～10%的芒果皮則被拋棄，不僅浪費(fèi)資源，而且污染環(huán)境。因此，如何利用廢棄的芒果皮資源，進(jìn)行開發(fā)利用，變廢為寶，具有十分重要的意義。本文對芒果皮的水提取物、乙醇提取物和石油醚提取物的清除自由基活性進(jìn)行研究，為芒果皮的科學(xué)開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑與儀器 AB204－N型電子天平（瑞士 Mettler公司）；Shi madzu UV2401PC紫外可見分光光度儀（日本島津公司）；HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋（天津市恒溫水浴鍋廠）；LD－500刀片式粉碎機(jī)（長沙市岳麓區(qū)常宏制藥機(jī)械設(shè)備廠）；PGX－330 A－12 H光照箱（寧波萊福科技有限公司）。核黃素（VB2）、氯化硝基四氮唑蘭（NBT），番紅花紅（Safranine T），蛋氨酸，2，2－二苯基－1－苦肼基（DPPH）購自Sig ma－Aldrich公司。乙醇、石油醚、二甲基亞砜（DMSO）為化學(xué)純，購自昆明汕滇精細(xì)化學(xué)品有限公司；其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 藥材 芒果，購自昆明水果市場。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 芒果皮提取物的制備 取新鮮成熟芒果，自來水洗凈，晾干，用水果刀均勻削取果皮，果皮厚度約1～5 mm。果皮置陽光下曬干，用刀片式粉碎機(jī)粉碎至20 mm以下。稱取粉碎后的芒果皮3份，50 g／份，分別加入水、95%乙醇和石油醚500 mL，加熱回流提取2 h，重復(fù)提取3次，提取液趁熱過濾，過濾液合并，減壓濃縮為浸膏，冷凍干燥，分別得到水提取物（EW）9.5 g，95%乙醇提取物（EEt）7.3 g和石油醚提取物（EP）3.8 g。取上述芒果皮的水提取物、95%乙醇提取物和石油醚提取物適量，以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑，配制不同濃度的待測溶液，備用。

從“有計(jì)劃的商品經(jīng)濟(jì)”到“社會主義市場經(jīng)濟(jì)”，從“民主法制”到“依法治國”，從“精神文明”到“文化強(qiáng)國”，從調(diào)整社會關(guān)系到構(gòu)建“和諧社會”，從植樹造林到“生態(tài)文明”，從“一國兩制”到香港、澳門回歸，從“革命與戰(zhàn)爭”到“和平與發(fā)展”，神州大地處處涌動(dòng)著改革的大潮，開放的窗口迎接著八面來風(fēng)。

產(chǎn)生的羥自由基（·OH）與指示劑發(fā)生反應(yīng)，當(dāng)體系中存在自由基清除劑時(shí)，清除劑與羥自由基作用，使羥自由基對指示劑的作用降低，通過檢測指示劑的變化情況，即可獲得清除劑對羥自由基的清除能力。根據(jù)所用指示劑，通常采用的方法有鄰二氮菲法和亞甲基藍(lán)（MB）法等。但這些方法多適用于測定單純的有機(jī)物的活性，不適用于組分復(fù)雜的提取物的羥自由基活性的測定。本文采用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基使番紅花紅褪色的方法來測定芒果皮提取物清除羥自由基的活性，該方法具有抗干擾能力強(qiáng)，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定可靠的特點(diǎn)。

說明低磷環(huán)境抑制了苦蕎根系生長，不耐低磷苦蕎受影響更嚴(yán)重。同時(shí)，各苦蕎幼苗莖葉干重的變化大于根系干重，這是根冠比值上升的主要原因。與正常供磷濃度(P1)相比，P2濃度下，除‘KQ10-11’外，其它基因型苦蕎根冠比均有升高；P3濃度下，各基因型苦蕎根冠比顯著升高，而‘KQ10-11’的根冠比卻顯著降低。說明不耐低磷苦蕎品種‘KQ10-11’的根系對低磷脅迫更敏感，受低磷脅迫影響程度更大。

芒果皮的95%乙醇提取物（EEt）和水提取物（EW）對超氧陰離子自由基的清除作用顯著強(qiáng)于石油醚提取物（EP）。3種提取物對超氧陰離子的清除作用與樣品濃度呈一定的線性關(guān)系，EP線性方程為y＝0.416 8x＋5.164 3，R2＝0.943 5，IC50＝107.57μg／mL；EW 線性方程為y＝0.7855x＋5.267 9，R2＝0.956 4，IC50＝56.95μg／mL；EEt在0～80μg／mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性，y＝1.099 5x＋3.64，R2＝0.987 3，IC50＝42.16μg／mL，當(dāng)樣品濃度≥80μg／mL，清除率隨濃度的變化趨緩。見圖2。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 對DPPH自由基的清除作用 DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液顯深紫色，在517 n m處有強(qiáng)吸收。當(dāng)與抗自由基活性物質(zhì)作用時(shí)，其孤對電子被配對，因而吸收消失或減弱，通過測定吸收減弱的程度，可評價(jià)自由基清除劑的活性。

2.3 超氧陰離子自由基清除能力測定 采用光照核黃素方法［8］。用p H 7.4的PSB緩沖液為溶劑，配制1.67×10～5 mol·L－1核黃素，0.01 mol·L－1蛋氨酸，4.6×10～5 mol·L－1氯化硝基四氮唑蘭（NBT）。分別取上述3種溶液各2.0 mL，加入1.2.1中不同濃度的待測試樣溶液1.0 mL，置光照箱中于4 500 lx下光照30 min，用紫外－可見分光光度計(jì)于560 nm處測定吸光度值A(chǔ)s；同法，以1.0 mL DMSO代替樣品溶液，測定吸光度值A(chǔ)0。用p H 7.4的PSB緩沖溶液6.0 mL＋DMSO 1.0 mL作參比溶液。取3次測試平均值，按下式計(jì)算清除率：

借鑒歐盟水框架分類分項(xiàng)建立標(biāo)準(zhǔn)的方法，建立北京山區(qū)河溪生態(tài)評價(jià)體系（表2）。基于北京地區(qū)的研究水平和對實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐的指導(dǎo)需求，本體系生物要素中的要素項(xiàng)暫時(shí)不包含魚類，各要素項(xiàng)生態(tài)質(zhì)量均分為4級；對水文地貌和物理化學(xué)兩大要素類不分要素項(xiàng)，生態(tài)質(zhì)量均分為5級。根據(jù)該分級體系和標(biāo)準(zhǔn)，針對各要素類或要素項(xiàng)分別評定生態(tài)質(zhì)量等級。

圖1 不同濃度下提取物對DPPH自由基的清除率

3.3 對羥自由基的清除作用 石油醚提取物（EP）線性方程y＝17.1x＋1.689 3，R2＝0.966 2，IC50＝2.83 mg／mL；水提取物（EW）在0～1.25 mg／mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性，y＝51.669x＋4.490 5，R2＝0.981 6，IC50＝0.88 mg／mL，當(dāng)樣品濃度≥1.25 mg／mL，清除率隨濃度的變化趨緩；95%乙醇提取物（EEt）在 0～1.00 mg／mL 范圍內(nèi)線性方程為 y＝84.52x＋9.08，R2＝0.935 5，IC50＝0.484 mg／mL，當(dāng)樣品濃度≥1.00 mg／mL，清除率隨濃度的變化明顯趨緩。對羥自由基的清除能力大小為EEt＞EW＞EP。見圖3。

2.4 羥自由基清除能力測定 采用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基使番紅花紅褪色的方法［9］。取p H 7.4的PSB緩沖溶液1.0mL，40μg／mL番紅花紅1.0 mL，0.945 mmol·L－1EDTA－Fe（Ⅱ）（新鮮配制）1.0 mL，加入2.1中不同濃度的待測試樣溶液0.5 mL，3%H2O2溶液1.0 mL（新鮮配制），混合后在37℃水浴中反應(yīng)30 min，用紫外－可見分光光度計(jì)在520 nm處測定吸光度As；同法，以0.5 mL DMSO代替樣品溶液，測定吸光度A0；以0.5 mL DMSO代替樣品溶液，以1.0 mL蒸餾水代替3%H2O2溶液，測定吸光度A。用3.5 mL蒸餾水＋PSB緩沖溶液1.0 mL作參比溶液。取3次測試平均值，按下式計(jì)算清除率：

圖2 不同濃度下提取物對超氧陰離子自由基的清除率

2.2 DPPH自由基清除能力測定［7］DPPH用70%的乙醇配制成5×10～5 mol／L的溶液。取上述5×10～5 mol／L的DPPH溶液3.0 mL，加入2.1中不同濃度的待測試樣溶液1.0 mL，于25℃反應(yīng)15 min，用紫外－可見分光光度計(jì)于517 n m處測定吸光度值A(chǔ)s；取5×10～5 mol／L的DPPH 3.0 mL，加入DMSO 1.0 mL，同法測定吸光度值A(chǔ)0。用70%乙醇3.0 mL＋DMSO 1.0 mL作參比溶液。取3次測試平均值，按下式計(jì)算清除率：

3.2 對超氧陰離子自由基的清除作用 用光照核黃素的方法產(chǎn)生超氧陰離子自由基，可使氯化硝基四氮唑蘭產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，該物質(zhì)在560 n m處有最大吸收峰。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，藍(lán)色物質(zhì)的生成就越多，加入芒果皮提取物樣品溶液可使超氧陰離子自由基的產(chǎn)生受到抑制，進(jìn)而藍(lán)色物質(zhì)的生成也受到抑制。測定該波長下的吸光度值的變化，可反映芒果皮提取物對超氧陰離子自由基的清除能力。

芒果皮的水提取物（EW）、95%乙醇提取物（EEt）和石油醚提取物（EP）對DPPH自由基均有良好的清除作用，濃度越高，清除能力越強(qiáng)。通過回歸分析，得EP的DPPH自由基清除率線性方程為y＝10.6x＋4.954 5，R2＝0.954，IC50＝4.25 μg／mL；EW 線性方程為y＝13.707x＋5.477 3，R2＝0.954 5，IC50＝3.25μg／mL；EEt線性方程為y＝15.658x＋6.572 7，R2＝0.948 5，IC50＝2.77μg／mL。IC50越小，抗自由基活性越強(qiáng)。依據(jù)IC50值，3種提取物對DPPH自由基的清除能力大小為EEt＞EW＞EP。見圖1。

羥自由基非常活潑，在含氧自由基中其氧化活性最強(qiáng)，但存在時(shí)間短，一般難于直接測定。本文采用間接法測定，其原理是利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基：作用，其在藥品和保健品方面的應(yīng)用開發(fā)具有巨大潛力，前景廣闊。本研究結(jié)果為芒果皮的深入開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

圖3 不同濃度下提取物對羥自由基的清除率

4 結(jié)論

本文研究表明，芒果皮的3種溶劑提取物對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基均有很好的清除作用，并且清除率與樣品濃度呈一定的線性關(guān)系，濃度越高，清除作用越強(qiáng)；采用不同的提取溶劑，所得到的提取物清除自由基的能力存在顯著差異，對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基的清除能力為乙醇提取物＞水提取物＞石油醚提取物。因此，提取芒果皮的溶劑以選擇乙醇為宜。

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行資料統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的定性資料采用χ2檢驗(yàn)，定量資料采用方差分析或重復(fù)測量設(shè)計(jì)方差，非正態(tài)分布資料采用非參數(shù)Kruskal-Wallis（校正）檢驗(yàn)。

依據(jù)《導(dǎo)基》課程內(nèi)容、考試大綱及導(dǎo)游人員崗位能力培養(yǎng)要求，進(jìn)行總結(jié)和歸納，收集素材，分教學(xué)階段構(gòu)建教學(xué)的內(nèi)容項(xiàng)目和任務(wù)體系（如表1）。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，自由基會引起人體蛋白質(zhì)變性、酶失活、DNA鏈斷裂、生物膜結(jié)構(gòu)損傷、細(xì)胞解體乃至機(jī)體病變和死亡，自由基及其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)是導(dǎo)致生物衰老和某些疾病如癌癥、糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心腦血管疾病等的重要因素。本文研究表明，芒果皮提取物對不同的自由基均有良好的清除

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