攜帶mIFN－γ的溶瘤病毒CNHK300－mIFN－γ對腫瘤細胞的體外殺傷作用*

彭林輝， 周 杰， 霍 楓， 蒲淼水， 張 琪， 蘇長青， 錢其軍， 萬云樂

(1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院肝膽外科，廣東廣州510515;2中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院肝膽外科，廣東廣州510210;3廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院肝膽外科，廣東廣州510010;4中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院肝臟病醫(yī)院實驗室，廣東廣州510630;5第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院基因－病毒治療實驗室，上海200438)

溶瘤病毒是應(yīng)用基因工程的方法將病毒基因組進行改造，使得病毒感染、復(fù)制及溶解細胞的能力在腫瘤細胞內(nèi)得到有效增強，而對正常細胞影響大為減少;其相應(yīng)的治療理念被稱為病毒治療［1］，是腫瘤治療的研究熱點。但進入臨床發(fā)現(xiàn)，單純病毒治療時腫瘤的殺傷效率不夠高，如研究較為成功的溶瘤病毒ONYX－015單獨應(yīng)用治療頭頸部腫瘤有效率不到10%［2］。理論上，在溶瘤腺病毒中插入具有抗癌作用的基因，相應(yīng)的細胞因子將隨著病毒在腫瘤細胞中感染、增殖而大量表達，協(xié)同殺滅腫瘤，這是更有前景的抗癌新策略［3］。我們將具有抗腫瘤作用的小鼠干擾素 γ(mouse interferonγ，mIFN－γ)基因插入溶瘤病毒CNHK300，構(gòu)建了基因病毒治療系統(tǒng)CNHK300－mIFN －γ(CNHK300 －Mγ)［4］。為了明確治療基因插入是否影響溶瘤病毒的抗腫瘤作用和插入基因的表達情況，本研究采用人肺癌細胞株A549、人肝癌細胞株SMMC－7721、人胰腺癌細胞株P(guān)ANC－1和正常人成纖維細胞株BJ，以CNHK300、ONYX－015和攜帶 mIFN－γ的非增殖型腺病毒AdEasy－mIFN －γ(AdEasy－Mγ)作為對照，進行CNHK300－Mγ的抗腫瘤實驗研究。

材料和方法

1 材料來源

人胚胎腎(HEK)293細胞株購自Microbix Biosystems。細胞株 BJ、A549和 PANC－1購于 American Type Culture Collection(ATCC)，細胞株SMMC－7721購于中國科學(xué)院上海細胞研究所。腺病毒ONYX－015由美國加州大學(xué)Berk AJ教授惠贈。重組腺病毒CNHK300、CNHK300－Mγ和AdEasy－Mγ由本實驗室重組并保存。各細胞株培養(yǎng)液、培養(yǎng)血清及抗生素參照供應(yīng)商推薦，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，0.25%胰酶消化細胞、傳代。

2 主要方法

2．1 病毒的擴增與純化 腺病毒擴增采用HEK293細胞;病毒純化采用常規(guī)氯化銫梯度離心純化法;采用Qbiogene公司的TCID50法測定病毒滴度。

2．2 病毒增殖實驗 分別收集上述腫瘤及正常細胞株、計數(shù)，按5×106cells/well接種6孔板。24 h后當(dāng)腫瘤細胞達到對數(shù)生長期，正常細胞達到接觸抑制，按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=5分別感染 CNHK300－Mγ、CNHK300和 ONYX－015。MOI為病毒數(shù)量與細胞數(shù)量之比。感染2 h后，將培養(yǎng)液替換成5%血清培養(yǎng)液，放置在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。收集感染0、48 h細胞凍融液及上清，TCID50法測定病毒滴度，以0 h病毒滴度為對照，算出病毒的增殖倍數(shù)。

2．3 細胞病理效應(yīng)(cytopathic effect，CPE) 將上述腫瘤及正常細胞按5×104cells/well的密度植入24孔板中，每孔加入1 mL的培養(yǎng)基。24 h后對細胞換用無血清培養(yǎng)液，按 MOI=0、0．01、0．1、1、10、100分別加入病毒CNHK300－Mγ、CNHK300和ONYX－015，十字法搖勻，2 h后換用5%血清培養(yǎng)液，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)7 d，每天觀察細胞的生長情況，7 d后吸掉細胞培養(yǎng)液，每孔加入500 μL結(jié)晶紫染色液(2%結(jié)晶紫溶于20%甲醇)，室溫染色15 min，在純水中充分洗滌掉多余染液后拍照記錄。

2．4 細胞殺傷實驗 接種上述腫瘤及正常細胞至96孔細胞培養(yǎng)板(1×104cells/well)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，按梯度MOI值感染細胞，分別加入病毒CNHK300－Mγ、CNHK300和ONYX－015，7 d后棄去病毒殘液，四唑鹽比色實驗(MTT assay)檢測3種病毒對各種細胞的殺傷作用。用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長下測定光吸收值，參考波長為650 nm。每個病毒MOI值做8個復(fù)孔，獨立重復(fù)3次。

2．5 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA) 分別收集上述腫瘤及正常細胞株、計數(shù)，按5×104cells/well接種24孔板。24 h后當(dāng)腫瘤細胞達到對數(shù)生長期，正常細胞達到接觸抑制，分別按MOI=1感染CNHK300－Mγ和AdEasy－Mγ。感染2 h后，將培養(yǎng)液替換成5%血清培養(yǎng)液，放置在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。收集感染3 d、7 d細胞培養(yǎng)上清液，用ELISA檢測其中mIFN－γ的表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17．0進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析和相關(guān)分析檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CNHK300－Mγ和CNHK300病毒的擴增與純化

與野生型腺病毒比較，重組病毒CNHK300由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)啟動子調(diào)控E1A基因，而重組腺病毒CNHK300－Mγ，在hTERT之前插入了CMV啟動子調(diào)控mIFN－γ的基因表達盒。病毒在HEK293細胞中反復(fù)擴增到需要量，純化后進行滴度測定，CNHK300－Mγ和CNHK300滴度測定分別為1．0×1012pfu/L和1．6×1012pfu/L。

2 3種病毒在腫瘤細胞和正常細胞中的增殖情況

攜帶治療基因的溶瘤腺病毒CNHK300－Mγ在惡性腫瘤細胞中選擇性增殖，在腫瘤細胞株中的增殖倍數(shù)是正常細胞株中的數(shù)百倍(P＜0．01)，見圖1。在腫瘤細胞株和正常細胞株增殖差異比較中發(fā)現(xiàn)，A549/BJ、SMMC －7721/BJ和 PANC －1/BJ在CNHK300－Mγ分別為157、622和540，在 CNHK300分別為233、204和262，在 ONYX－015分別為15、1.2和12。由此可見，與 CNHK300相比，mIFN－γ基因插入后，在各種細胞中的增殖能力均有所下降，但腫瘤細胞內(nèi)的選擇性增殖能力沒有下降;與ONYX－015相比，CNHK300－Mγ顯示出更為特異的腫瘤細胞內(nèi)選擇性增殖能力(P＜0．01)。

Figure 1．The replicative folds of CNHK300－Mγ，CNHK300 and ONYX－015 in normal and cancer cell lines．ˉx±s．n=5，＊＊P ＜0．01 vs BJ;#P ＜0.05，##P ＜0．01 vs ONYX －015．圖1 3種病毒在腫瘤細胞和正常細胞中48 h的增殖情況

3 3種病毒對腫瘤細胞株和正常細胞株的殺傷能力

圖2 顯示，CNHK300－Mγ對腫瘤細胞株的殺傷能力明顯高于正常細胞株，在MOI值為1時均基本殺滅，而正常細胞株MOI值為100時才有殺傷力。與ONYX－015相比，CNHK300－Mγ在腫瘤細胞株的殺傷能力明顯增強，而在正常細胞株中殺傷力進一步減弱。

Figure 2．The killing effect of CNHK300－Mγ，CNHK300 and ONYX －015 in normal and cancer cell lines detected by cytopathic effect assay．1:CNHK300;2:ONYX －015;3:CNHK300－Mγ．圖2 3種病毒在腫瘤細胞和正常細胞中的細胞病理效應(yīng)

4 3種病毒對腫瘤細胞和正常細胞的殺傷作用

CNHK300－Mγ和CNHK300均顯示了對腫瘤細胞株強大的選擇性殺傷力，腫瘤細胞株與正常細胞株之間殺傷力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)，見圖3。ONYX－015雖然對腫瘤細胞株有較強的殺傷作用，但要獲得與CNHK300－Mγ和CNHK300同樣的效果，需要更高的MOI值(P＜0．01)，而對于正常細胞株，獲得類似效果，更低的 MOI值就可達到(P＜0.05)。病毒對不同細胞增殖的半數(shù)抑制濃度表明，與ONYX－015相比，CNHK300－Mγ對正常細胞株的殺傷力減弱，但對腫瘤細胞的殺傷力明顯提高，特別是在SMMC－7721中，后者是前者的93倍，見表1。

Figure 3．The viability of normal and cancer cell lines infected with the 3 viruses at various MOI detected by MTT assay．ˉx±s．n=24．#P＜0.05，##P＜0.05 vs ONYX－015．圖3 3種病毒在腫瘤細胞和正常細胞中的細胞殺傷實驗

表1 3種病毒對不同細胞增殖的半數(shù)抑制濃度Table 1．The 50%inhibitory concentration(IC50)of the 3 viruses for various cell lines(pfu/cell)

5 mIFN－γ的表達

AdEasy－Mγ是攜帶mIFN－γ的非增殖型腺病毒，感染惡性腫瘤細胞后只有少量mIFN－γ的表達，感染時間延長，表達量變化不大，均低于1 500 ng/L;而CNHK300－Mγ感染惡性腫瘤細胞受后均有大量mIFN－γ的表達，均高于18 000 ng/L，感染的時間延長，表達量均成倍上升，在第3 d時后者為前者的17～334倍之間，在第7 d時后者為前者的272～5526倍之間，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)，見圖4。然而正常細胞株BJ，2種病毒感染后，mIFN－γ的表達量相似，均不高，感染的時間延長變化也不大(P＞0.05)。

Figure 4．The expression level of mIFN－γin the supernatants of cells infected with CNHK300－Mγor AdEasy－Mγ．ˉx±s．n=15，＊＊P＜0．01 vs BJ;##P＜0．01 vs AdEasy－Mγ．圖4 2種病毒在不同細胞株上清液中mIFN－γ的表達量

討 論

在病毒增殖必需基因的上游插入腫瘤組織特異性啟動子或增強子，可以使病毒只在特定的腫瘤細胞內(nèi)增殖，而在其它細胞內(nèi)處于失活狀態(tài)，如甲胎蛋白(alpha－ fetoprotein，AFP)啟動子［5］、前列腺癌特異性抗原(prostate － specific antigen，PSA)啟動子［6］、缺氧啟動子［7］、hTERT啟動子等。人端粒酶是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，在85%以上的腫瘤細胞中高表達，由端粒酶RNA、端粒酶結(jié)合蛋白和hTERT構(gòu)成，其中hTERT的表達與端粒酶活性高度相關(guān)［8］，是決定其活性的主要因素［9］。CNHK300病毒系統(tǒng)是本室構(gòu)建的用hTERT啟動子控制E1A表達而獲得的溶瘤病毒，具有選擇性裂解端粒酶陽性腫瘤細胞的能力，與ONYX－015相比，在體外實驗和荷瘤動物實驗均顯示了更強的抗腫瘤效果［10］。

為了優(yōu)化溶瘤病毒的抗癌性，我們進一步將CNHK300攜帶上治療基因，期望治療基因在端粒酶陽性的腫瘤細胞中選擇性地高表達，增強抗腫瘤效果。IFN－γ是已證實有多重抗癌作用的細胞因子，其機制主要有［11－12］:(1)多重的免疫調(diào)節(jié)作用:調(diào)節(jié)MHCⅠ和MHCⅡ類分子在大多數(shù)免疫細胞內(nèi)的表達;誘導(dǎo)Th2向Th1分化，減少病毒抗體產(chǎn)生;增加LAK(淋巴因子激活的殺傷細胞)的抗腫瘤活性;增強腫瘤壞死因子的抑瘤作用等;(2)直接抑制腫瘤血管生成;此外，它還能影響細胞周期，誘導(dǎo)細胞凋亡，直接殺傷腫瘤細胞。目前IFN－γ已應(yīng)用到臨床試驗中［13］，但是半衰期短、穩(wěn)定差、活性低、費用高，高劑量反復(fù)注射方能取得一定的療效，應(yīng)用明顯受限。

前期研究中我們將含mIFN－γ的外源基因表達盒插入到溶瘤病毒CNHK300的基因組中，成功地構(gòu)建一種新的基因－病毒治療系統(tǒng)CNHK300－Mγ［4］。本研究發(fā)現(xiàn)mIFN－γ基因插入后，溶瘤病毒在各種細胞株中的增殖能力和殺傷能力均有所降低，但正常細胞下降更明顯，與CNHK300相比腫瘤細胞內(nèi)選擇性增殖能力和對腫瘤細胞的選擇性殺傷能力均無明顯下降，與ONYX－015相比，在腫瘤細胞中增殖能力和殺傷能力明顯增強，而在正常細胞中的毒性進一步下降。由此可見mIFN－γ基因的插入沒有改變?nèi)芰霾《咀陨硖禺愋詺缒[瘤細胞的能力。與AdEasy－Mγ相比，CNHK300－Mγ在惡性腫瘤細胞中能隨著病毒的增殖大量表達mIFN－γ，并隨時間相對延長，表達量成倍上升，能有效避免傳統(tǒng)基因治療中治療基因表達率低的主要缺點。

肺癌、肝癌和胰腺癌均是我國常見的重大疾病，一經(jīng)確診大部分為中晚期，治療非常棘手且預(yù)后不理想。國內(nèi)外文獻報道端粒酶陽性率在肺癌、肝癌和胰腺癌中為80%～100%，端粒酶活性的表達和腫瘤侵潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期顯著相關(guān)［9，14－15］。CNHK300 －Mγ 具有類似 CNHK300 的選擇性裂解端粒酶陽性腫瘤細胞的能力，同時也能隨著病毒大量增殖高效表達IFN－γ，具備了基因治療和病毒治療的雙重抗瘤作用，進一步動物實驗極可能顯示比CNHK300更強的抗瘤效果，擁有較高的惡性腫瘤治療潛力。

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