水通道蛋白4和8在人不同病理級(jí)別星形細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)*

朱淑娟， 孫善全△， 許士葉， 張興業(yè)， 甘勝偉

(1重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心，重慶400016;2西安市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安710038)

水分子和離子平衡的調(diào)節(jié)對(duì)維持正常腦功能是非常關(guān)鍵的。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞作為哺乳動(dòng)物腦內(nèi)最豐富的細(xì)胞類型，其調(diào)控作用主要依賴于水通道蛋白(aquaporins，AQPs)、離子通道蛋白及其錨定蛋白三者之間的相互作用而實(shí)現(xiàn)的［1］。大量的研究顯示:這些通道蛋白在細(xì)胞的表達(dá)和極化分布方式被打亂之后，將引起離子和細(xì)胞容積的平衡被破壞。另外，血腦屏障中水通道的表達(dá)變化也是膠質(zhì)瘤性腦水腫發(fā)生的重要分子機(jī)制［2］，但對(duì)其增殖、生長機(jī)制仍無定論。本實(shí)驗(yàn)從星形膠質(zhì)瘤的惡性程度角度，探討了 AQPs成員中AQP4和AQP8在人不同病理級(jí)別星形細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)變化，為初步闡明AQPs在星形細(xì)胞瘤增殖生長中的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 病例及標(biāo)本采集

星形細(xì)胞瘤標(biāo)本均取自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科和第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院神經(jīng)外科星形細(xì)胞瘤的患者，共55例;以患者腫瘤周圍相對(duì)正常腦組織作為對(duì)照組。所有標(biāo)本自術(shù)中取出后，一部分用于病理檢查，另一部分則置于液氮中迅速冷凍后，－80℃保存。經(jīng)病史詢問，所有患者術(shù)前均未接受過免疫治療、放療、化療等治療手段。

2 主要試劑及儀器

單克隆小鼠抗人AQP4和AQP8抗體均購自Abcam;辣根酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG、山羊抗小鼠IgG、DAB顯色試劑盒和Ⅱ抗試劑盒購自中杉金橋公司;β－actin抗體購自武漢博士德公司;SDS聚丙烯酰胺凝膠配置試劑盒、Trizol和AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa。

3 HE及免疫組織化學(xué)染色

將所取相對(duì)正常腦組織與各級(jí)星形膠質(zhì)瘤組織常規(guī)固定后，行石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為5μm。脫蠟后HE染色，進(jìn)行診斷和病理分級(jí)。選片，常規(guī)脫蠟，枸櫞酸鹽溶液(pH 6．0)修復(fù)(95℃，40 min)后，按照二步法試劑盒說明書操作，AQP4Ⅰ抗?jié)舛葹?∶500(PBS 配制)，AQP8Ⅰ抗?jié)舛葹?1∶350(PBS配制)，DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水透明后封片，顯微鏡觀察。采用北航生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(CM－2000B)進(jìn)行圖像分析，測定免疫組化陽性反應(yīng)細(xì)胞的積分吸光度值(IA)。

4 Western blotting檢測

用細(xì)胞裂解液(碧云天)提取對(duì)照組和各級(jí)星形膠質(zhì)瘤組織樣品總蛋白，10%SDS－PAGE凝膠分離蛋白，通過濕轉(zhuǎn)方式將蛋白轉(zhuǎn)至0．45μm孔徑的硝酸纖維膜上，用Ⅰ抗封閉液室溫封閉2 h后，分別加入含 AQP4(1∶1 500)、AQP8(1∶1 000)和 β － actin(1∶5 000)的Ⅰ抗稀釋液(PBS配制)，4℃過夜孵育，PBST洗膜3次，10 min/次，分別滴加山羊抗小鼠IgGⅡ抗(1∶5 000)(PBS配制)稀釋液，37℃孵育2 h，PBST洗膜3次，10 min/次，DAB 試劑盒顯色，用Quantity One軟件轉(zhuǎn)換后BandScan軟件測定條帶灰度值。將AQP4和AQP8分別與β－actin灰度值的比值作為觀察指標(biāo)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT－PCR)

對(duì)照組及不同病理級(jí)別星形膠質(zhì)瘤組織各100 mg。按Trizol提取程序(說明書)提取組織總RNA;按AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，4℃保存。擴(kuò)增引物:AQP4上游引物5'－ggaatttctggccatgctta－3'，下游引物 5'－ aagacagacttggcgatgct－3'，擴(kuò)增片段產(chǎn)物長231 bp。AQP8上游引物5'－tcctgaggagaggttctgga－3'，下游引物 5'－ agagggccctttgtcttctc－3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長159 bp。β－actin上游引物5'－ ctgccgcatcctcttcctc－3'，下游引物 5'－ ctcctgcttgctgatccacat－3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長 398 bp。擴(kuò)增條件:94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 20 s，共35個(gè)循環(huán)。2%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像儀觀察并照相，用Band Scan 5．0軟件測定條帶灰度值，將 AQP4 mRNA、AQP8 mRNA分別與β－actin mRNA灰度值的比值作為觀察指標(biāo)，做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，采用SPSS 13．0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，運(yùn)用兩組間比較的秩和檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 病理診斷結(jié)果

按照世界衛(wèi)生組織(WHO)對(duì)腦細(xì)胞瘤分級(jí)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示:星形細(xì)胞瘤Ⅰ級(jí)5例，星形細(xì)胞瘤Ⅱ級(jí)17例，間變性星形細(xì)胞瘤(Ⅲ級(jí))19例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Ⅳ級(jí))14例，見圖1。

Figure 1．Different pathological grades of the astrocytoma samples(HE staining，×400)．A:astrocytoma(WHO gradeⅠ);B:astrocytoma(WHO gradeⅡ);C:anaplastic astrocytoma(WHO gradeⅢ);D:glioblastoma(WHO gradeⅣ)．圖1 星形細(xì)胞瘤標(biāo)本的病理分級(jí)

2 AQP4和AQP8的免疫組織化學(xué)結(jié)果

對(duì)照組中AQP8主要表達(dá)在神經(jīng)元和少量星形細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)，各病理級(jí)別星形細(xì)胞瘤組織中AQP4和AQP8主要表達(dá)在瘤性星形細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)內(nèi)。圖像分析結(jié)果顯示，和對(duì)照組比較，低級(jí)別(Ⅰ～Ⅱ級(jí))腫瘤組織中AQP4表達(dá)減少(P＜0．05)，高級(jí)別(Ⅲ～Ⅳ級(jí))腫瘤組織中AQP4表達(dá)增多(P＜0．05);而低級(jí)別腫瘤組織中AQP8的表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，高級(jí)別腫瘤組織中AQP8的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)(P＜0.05);低級(jí)別(WHOⅠ～Ⅱ級(jí))腫瘤組織之間、高級(jí)別(WHOⅢ～Ⅳ級(jí))腫瘤組織之間比較，AQP4和AQP8表達(dá)均無明顯差異(P＞0．05)，見圖2、3和表1。

Figure 2．The immunohistochemical staining of AQP4( ×400)．A:astrocytoma(WHO gradeⅠ);B:astrocytoma(WHO gradeⅡ);C:anaplastic astrocytoma(WHO gradeⅢ);D:glioblastoma(WHO gradeⅣ);E:control group．圖2 免疫組化染色顯示AQP4的分布

Figure 3．The immunohistochemical staining of AQP8( ×400)．A:astrocytoma(WHO gradeⅠ);B:astrocytoma(WHO gradeⅡ);C:anaplastic astrocytoma(WHO gradeⅢ);D:glioblastoma(WHO gradeⅣ);E:control group．圖3 免疫組化染色顯示AQP8的分布

表1 對(duì)照組和各不同病理級(jí)別星形細(xì)胞瘤組織中AQP4和AQP8的免疫組化染色Table 1．The IA of AQP4 and AQP8 positive cells in control group and astrocytoma tissues of various pathological grades(IA．ˉx±s．n=9)

3 AQP4和AQP8及其mRNA的含量變化

Western blotting與RT－PCR結(jié)果一致顯示，在對(duì)照組及各腫瘤組織中均可看到AQP4和AQP8及其mRNA特定的免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物。條帶分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，隨腫瘤病理級(jí)別的升高，AQP4及其mRNA在低級(jí)別腫瘤組織(WHOⅠ～Ⅱ級(jí))中表達(dá)減少(P＜0．05)，而在高級(jí)別腫瘤組織(WHOⅢ～Ⅳ級(jí))中表達(dá)增強(qiáng)，和對(duì)照組及低級(jí)別腫瘤組織(WHOⅠ～Ⅱ級(jí))比較，P＜0．05。AQP8及其 mRNA在低級(jí)別腫瘤組織表達(dá)增強(qiáng)(P＜0．05)，在高級(jí)別腫瘤組織中表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，和對(duì)照組及低級(jí)別腫瘤組織(WHOⅠ～Ⅱ級(jí))比較，P＜0．05。AQP4和 AQP8在低級(jí)別腫瘤組織之間、高級(jí)別腫瘤組織之間分別比較，P ＞0．05，見圖4、5。

討 論

1 AQP4在星形細(xì)胞瘤中的作用

AQP4是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)主要的水通道蛋白，首次在大鼠肺臟被克?。?］;AQP4廣泛分布于脊髓、視網(wǎng)膜、內(nèi)耳及骨骼肌等興奮性組織［4－6］中的神經(jīng)支持細(xì)胞，如:中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞，視網(wǎng)膜 Müller膠質(zhì)，內(nèi)耳 Hensen's、Claudius和內(nèi)溝細(xì)胞等。在腦內(nèi)，AQP4多集中在毛細(xì)血管周圍的膠質(zhì)細(xì)胞終足膜、膠質(zhì)界膜、室管膜細(xì)胞及室管膜下的星形細(xì)胞，主要控制腦內(nèi)水的流動(dòng)，促使星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移，改變神經(jīng)元活性。AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜的極化分布與血管內(nèi)皮細(xì)胞向星形細(xì)胞傳遞信號(hào)有關(guān)。AQP4不僅是一種通道蛋白，而且還是一種滲透壓感受器，它除了調(diào)節(jié)腦組織的水代謝之外還可能在腦脊液形成和細(xì)胞容積變化方面具有重要作用［7］;另外［8］，AQP4 和 Kir4．1 在功能方面相互作用，參與星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上水的轉(zhuǎn)運(yùn)和鉀離子的虹吸。

Figure 4．Expression of AQP4(A)and AQP8(B)proteins in human astrocytoma tissues of various pathological grades and control group．1:control group;2:astrocytoma(WHO gradeⅠ);3:astrocytoma(WHO gradeⅡ);4:anaplastic astrocytoma(WHO grade Ⅲ);5:glioblastoma(WHO gradeⅣ)．ˉx±s．n=9．*P＜0．05 vs control;#P＜0．05 vs gradeⅠorⅡ．圖4 星形細(xì)胞瘤組織中AQP4和AQP8蛋白的表達(dá)

Figure 5．Expression of AQP4(A)and AQP8(B)mRNA．M:marker;1:control group;2:astrocytoma(WHO gradeⅠ);3:astrocytoma(WHO gradeⅡ);4:anaplastic astrocytoma(WHO gradeⅢ);5:glioblastoma(WHO gradeⅣ)．ˉx±s．n=9．*P＜0．05 vs control;#P ＜0．05 vs gradeⅠorⅡ．圖5 星形細(xì)胞瘤組織中AQP4和AQP8 mRNA的表達(dá)

Saadoun等［9］應(yīng)用免疫組化在5例患者腦腫瘤組織(沒有進(jìn)行病理分級(jí))中發(fā)現(xiàn)AQP4表達(dá)減弱，Warth等［10］又在高級(jí)別星形細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)AQP4高表達(dá);關(guān)于AQP4在不同病理級(jí)別的星形細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)情況尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AQP4在低級(jí)別星形膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)減少，而在高級(jí)別腫瘤組織中表達(dá)增強(qiáng)，與Saadoun和Warth的結(jié)果相符合。AQP4在低級(jí)別腫瘤組織中呈現(xiàn)胞內(nèi)及胞膜弱表達(dá)，提示低級(jí)別星形細(xì)胞瘤細(xì)胞可能出現(xiàn):(1)AQP4生成減少;(2)AQP4錨定機(jī)制損傷，重新分布。AQP4在高級(jí)別星形細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)升高可能與腫瘤細(xì)胞在快速增殖生長過程中的水轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，然而這些推測尚須進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

2 AQP8在星形細(xì)胞瘤中的作用

AQP8作為水通道蛋白家族成員之一，主要分布在消化道上皮細(xì)胞(特別是結(jié)腸)、肝及胰腺以及男性和女性生殖系統(tǒng)，但其功能至今仍不甚清楚。人AQP8 cDNA編碼261個(gè)氨基酸，其74．1%和大鼠AQP8同源，76%和小鼠同源。AQP8基因含有5個(gè)內(nèi)含子，外顯子－內(nèi)含子分界點(diǎn)和其它哺乳動(dòng)物不同，這可能和種系發(fā)生有關(guān)。人AQP8位于染色體16p12 位點(diǎn)［11］。實(shí)驗(yàn)顯示［12］，在分離純化的大鼠AQP8、人AQP8和小鼠AQP8蛋白中，人AQP8轉(zhuǎn)運(yùn)水分子和氨，不轉(zhuǎn)運(yùn)甘油和尿素，其可能在酸堿平衡中發(fā)揮重要作用。Su等［13］利用AQP8基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)AQP8缺失可以通過減少卵泡細(xì)胞的凋亡而增加成熟卵泡細(xì)胞的數(shù)量。在原發(fā)性羊水過多時(shí)［14］，羊膜上的AQP8表達(dá)增加，而在胎盤卻表達(dá)下降，提示AQP8在調(diào)節(jié)羊水體積方面起了重要作用。

肝細(xì)胞主要表達(dá)AQP8，AQP8起初位于胞內(nèi)囊泡，在雙丁酰 cAMP的誘導(dǎo)下，重新定位至漿膜上［15］。胰高血糖素可誘導(dǎo)劑量依賴性的漿膜AQP8表達(dá)上調(diào)，同時(shí)胞內(nèi)膜AQP8的下降，表明AQP8從胞內(nèi)囊泡到漿膜的再分布。有文獻(xiàn)報(bào)道，正常肝細(xì)胞通過AQP依賴的水轉(zhuǎn)運(yùn)快速對(duì)滲透壓變化作出反應(yīng)，從而遭遇凋亡后的細(xì)胞死亡結(jié)局;在原代培養(yǎng)的雞肝細(xì)胞膜上，30 mmol/L的高糖即可增加AQP8的轉(zhuǎn)位(從胞內(nèi)膜移動(dòng)到胞漿膜)，并呈濃度依賴性，30 mmol/L甘露醇沒有影響 AQP8 轉(zhuǎn)位［16］;Magdeldin等［17］研究表明，actin相關(guān)蛋白家族可能參與調(diào)節(jié)AQP8分泌小泡遷移并整合到細(xì)胞膜的過程。與正常肝細(xì)胞相比，肝細(xì)胞癌AQP8和AQP9表達(dá)明顯下調(diào)［18］，AQP8和AQP9過表達(dá)可促進(jìn)肝細(xì)胞的凋亡。上述結(jié)果提示，AQP8轉(zhuǎn)位至胞膜時(shí)，可發(fā)揮其水分子快速轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。Calamita等［21］的實(shí)驗(yàn)研究表明:AQP8介導(dǎo)的水轉(zhuǎn)運(yùn)在線粒體快速腫脹過程中起著非常重要的作用。

盡管水分子進(jìn)出線粒體的運(yùn)動(dòng)對(duì)維持其形態(tài)和功能十分重要，然而水分子通過線粒體內(nèi)膜的分子機(jī)制仍然不清楚。資料顯示［19］，線粒體決定細(xì)胞的生死狀態(tài)。在生理?xiàng)l件下，AQP8和AQP9表達(dá)在不同組織細(xì)胞的線粒體內(nèi)膜上(包括肝、腎和腦)，調(diào)節(jié)水分子和代謝底物的轉(zhuǎn)運(yùn)，參與凋亡刺激引起的滲透膨脹。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［20］，AQP8介導(dǎo)的線粒體對(duì)甲酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)能力高于對(duì)水的轉(zhuǎn)運(yùn)，表明線粒體內(nèi)膜上AQP8的主要作用是轉(zhuǎn)運(yùn)氨。凋亡作為保守的細(xì)胞過程，最早的形態(tài)學(xué)特征之一是顯著的細(xì)胞皺縮(AVD)。于 AVD期間，在 Na+/K+ATP酶抑制之后，Na+、K+被擠出細(xì)胞，胞外Na+堆積，細(xì)胞內(nèi)外離子濃度發(fā)生變化，從而形成一個(gè)滲透梯度，激活A(yù)QPs其它成員(如:AQP4的表達(dá))，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)水分子外流，最終導(dǎo)致細(xì)胞皺縮。

Fischer等［22］發(fā)現(xiàn)，AQP8 分布在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞的腔面，而在結(jié)腸癌組織中，AQP8沒有或極少表達(dá)。由此可見，AQP8在細(xì)胞內(nèi)、外水電解質(zhì)分布失衡的過程中，具有重要作用，其過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而在腫瘤細(xì)胞，AQP8表達(dá)下調(diào)，則可維持腫瘤細(xì)胞的增殖與生長。然而，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在星形細(xì)胞瘤組織中，AQP8大量分布在瘤細(xì)胞的胞膜和胞漿內(nèi)，這可能與AQP8的合成增多有關(guān);AQP8的表達(dá)和腫瘤病理級(jí)別相關(guān):與對(duì)照組相比較，AQP8在低級(jí)別腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，在高級(jí)別腫瘤組織中表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。推測腫瘤細(xì)胞在增殖的過程中，體積增大，含水量增加;水通道蛋白在快速轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的同時(shí)，腫瘤細(xì)胞可獲取大量營養(yǎng)物質(zhì)和必需的生長因子以備增殖［23］。

由此看來，在不同部位，AQP8的分布具有差異性;在不同病理生理?xiàng)l件下，AQP8的表達(dá)同樣具有差異性;在細(xì)胞的生長去向過程中，AQP8究竟促使其走向凋亡還是永生化，其作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

(致謝:感謝重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科孫曉川教授、何朝輝博士和第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院神經(jīng)外科沈光建教授在標(biāo)本采集方面給予的幫助。)

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