人促紅素對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血清Th17細(xì)胞因子表達(dá)的影響Δ

徐毅暉，楊元生，陳 墾，葉 升，陳婧華，杜政委，王 暉(.廣東藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)教研室，廣州 500;.廣東藥學(xué)院附屬第二醫(yī)院，廣州 500;.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 50080;.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣州 50006)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是腸道非特異性炎癥反應(yīng)性疾病，以慢性腹痛、腹瀉或黏液膿血便為其臨床特點(diǎn)，近年來隨著人們生活水平的提高，其患病率亦逐年上升。研究顯示UC的發(fā)病與腸道免疫系統(tǒng)被激活、抗炎與促炎因子失衡密切相關(guān)，目前治療無特效藥，深入研究UC的發(fā)病機(jī)制對探索新藥治療UC有重要意義。人促紅素(human erythropoietin，hEPO)是腎臟分泌的具有促進(jìn)紅細(xì)胞成熟的細(xì)胞因子，被廣泛應(yīng)用于治療腎性相關(guān)貧血。近年研究還發(fā)現(xiàn)hEPO有保護(hù)組織免受缺血再灌注損傷、抑制炎癥反應(yīng)、改善體液和細(xì)胞免疫功能等［1］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察 Th17 相關(guān)細(xì)胞因子(IL－6、IL－17A)，進(jìn)而評價(jià)hEPO治療急性UC小鼠的療效，從而初步探討Th17在UC發(fā)病中的作用以及hEPO治療UC的可能作用機(jī)制，為hEPO治療UC提供臨床理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級BALB/C雌性小鼠30只，6～8周齡，體重22～25 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物編號:SCXK(粵)2008－0002，粵監(jiān)證字 2008A055)。葡聚糖硫酸鈉(DSS，Mr:5000，Sigma公司生產(chǎn));IL－17A、IL－6酶聯(lián)免疫吸附測定(Elisa)試劑盒(北京鼎國生物有限公司生產(chǎn));hEPO(4000 IU/支，沈陽制藥公司生產(chǎn))。Anthos 2010型酶標(biāo)儀(Anthos tabtec instranents公司生產(chǎn))、切片機(jī)(徠卡RM2135)、顯微鏡和全自動(dòng)脫水機(jī)(上海光學(xué)儀器一廠生產(chǎn))等。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與處理:30只BALB/C小鼠隨機(jī)分為3組:正常組、DSS模型組和hEPO組，每組10只。參照胡仁偉［2］的方法建立小鼠UC模型。禁食不禁水24 h后，正常組自由飲用蒸餾水，其余各組均自由飲用5%DSS(5 g DSS溶于100 mL蒸餾水)7 d。自造模第1 d開始，治療組給予hEPO 1000 IU·kg－1，用0.9%氯化鈉注射液稀釋至1 mL，腹腔注射，隔日1次，共4次，第8 d處死所有小鼠，眼球采血備用，分離留取病變結(jié)腸組織標(biāo)本備用。

1.2.2 疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)與結(jié)腸病理評分:腹腔給藥后每日觀察小鼠的體重、大便性狀和便血等情況，參考文獻(xiàn)進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評分［3］，DAI=(體重下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù))/3。正常大便為橢圓形小顆粒狀;半稀便為糊狀但不黏肛門;稀便為液狀且黏肛門;大便隱血用聯(lián)苯胺法檢測。將病變結(jié)腸標(biāo)本置于4%甲醛過夜固定、脫水、脫脂后石蠟包埋行常規(guī)切片、HE染色，結(jié)腸組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［4］。

1.2.3 血清IL－6和IL－17A含量測定:采血后室溫靜置2 h，4℃下12000轉(zhuǎn)離心15 min取上清液，按Elisa試劑盒方法測定血清 IL－6、IL－17A 含量，按照說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀450 nm檢測標(biāo)本的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出直線回歸方程，通過標(biāo)本的吸光度值代入回歸方程得出濃度值。以上操作均重復(fù)操作2次取其均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，計(jì)量資料中多組間比較行方差分析，兩兩比較行SNK－q檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用直線回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及DAI評分

正常組小鼠自由飲用蒸餾水后未見明顯異常，其余小鼠飲用5%DSS 24 h后均有不同程度的懶動(dòng)、拱背、厭食、腹瀉、體重下降等;DSS組小鼠均解稀便，7只小鼠有肉眼血便，各時(shí)間點(diǎn)DAI評分與其余2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);hEPO治療UC小鼠4 d后癥狀開始緩解，體重先減輕后逐漸增加;治療7 d，hEPO組小鼠癥狀明顯改善，精神好轉(zhuǎn)，食欲增加，偶有稀便，未見黏液血便，小鼠DAI評分與DSS組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)DAI評分及病理學(xué)評分，n=10)Tab 1 The scores of colon pathology and DAI in difference time of mouse in each group(，n=10)

表1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)DAI評分及病理學(xué)評分，n=10)Tab 1 The scores of colon pathology and DAI in difference time of mouse in each group(，n=10)

注:與DSS組比較，▲P＜0.05;與正常組比較，△P＜0.05note:vs.DSS group，▲P＜0.05;vs.normal group，△P ＜0.05

組別 DAI評分d1 d4 d病理學(xué)評分正常組 0.23±0.231▲ 0.11±0.132▲ 0▲ 0.63±0.5137▲模型組 2.47±0.431△ 2.21±0.314△ 1.00±0.163△ 10.30±1.095△hEPO組 2.01±0.511△ 1.15±0.273▲△ 0.45±0.121▲△ 4.11±0.532▲△

2.2 結(jié)腸病理組織學(xué)觀察

2.2.1 肉眼觀察:正常組小鼠結(jié)腸未見明顯病變，而DSS組小鼠見病變結(jié)腸明顯充血、水腫，散在腸壁壞死，腸壁與周圍組織有不同程度的黏連，沿腸系膜縱軸剪開腸腔見有鮮紅或暗紅色血性分泌物、腸壁黏膜散在多發(fā)糜爛和少許潰瘍點(diǎn)，呈彌漫性、連續(xù)性分布，病變多集中于乙狀結(jié)腸段。經(jīng)hEPO治療UC小鼠7 d后結(jié)腸黏膜病變較模型組明顯減輕，僅見部分腸道輕度充血、水腫，未見糜爛、潰瘍及出血病灶。

2.2.2 光鏡下觀察:正常小鼠結(jié)腸切片未見明顯病理變化，DSS組小鼠病變結(jié)腸黏膜可見糜爛、出血、黏膜上皮脫落、壞死及少許潰瘍形成，病變主要局限于黏膜層和黏膜下層，病變部位有大量淋巴細(xì)胞浸潤、杯狀細(xì)胞減少，部分伴有淋巴濾泡形成及腺體減少或缺失，組織病理學(xué)評分明顯高于正常組和hEPO組(P＜0.05);hEPO組小鼠結(jié)腸病變有明顯改善，腸黏膜少量炎細(xì)胞浸潤，散在輕微糜爛，未見潰瘍。各組小鼠結(jié)腸組織病理變化見圖1，組織病理學(xué)評分見表1。

2.3 血清IL-6、IL-17A含量

各組小鼠血清IL－6和IL－17A含量均有不同程度升高，與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);經(jīng)hEPO治療后小鼠血清含量均明顯下降(P＜0.05)，與DSS組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。IL－17A與IL－6相關(guān)分析顯示呈正性相關(guān)(r=0.913，P＜0.05)。

表2 各組 IL-6、IL-17A 含量，n=10)Tab 2 The contents of IL-6 and IL-17A in serum of mouse in each group，n=10)

表2 各組 IL-6、IL-17A 含量，n=10)Tab 2 The contents of IL-6 and IL-17A in serum of mouse in each group，n=10)

注:與DSS組比較，▲P＜0.05;與正常組比較，△P＜0.05note:vs.DSS group，▲P＜0.05;vs.normal group，△P ＜0.05

組別 IL－6(pg·mL － 1) IL－17 A(pg·mL － 1)正常組 52.199±6.329▲ 79015.271±927.526▲模型組 385.115±95.322△ 204945.153±39518.513△hEPO組 196.236±78.914▲△ 99663.325±8335.195▲△

3 討論

3.1 小鼠UC模型的評價(jià)

圖1 各組結(jié)腸病理切片圖譜Fig 1 The histopathological image of colon in each group

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是病因未明的胃腸道慢性復(fù)發(fā)性炎癥性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，且現(xiàn)有的藥物對病情控制欠佳，故該病的發(fā)病機(jī)制和治療一直是目前科研的熱點(diǎn)。良好的UC動(dòng)物模型是研究的關(guān)鍵，本實(shí)驗(yàn)采用DSS誘導(dǎo)小鼠UC模型，出現(xiàn)活動(dòng)減少、解稀爛便或血便、體重下降等癥狀，病變結(jié)腸出現(xiàn)腸黏膜糜爛、上皮脫落及潰瘍形成，固有層炎癥細(xì)胞浸潤，部分炎癥浸及肌層，杯狀細(xì)胞減少甚至消失，隱窩結(jié)構(gòu)破壞等，符合UC病理改變［2］，模型組小鼠病理改變與正常組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表1)，表明葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的UC模型成功且與人類UC的臨床表現(xiàn)和結(jié)腸病理改變極為相似，具有研究價(jià)值。

3.2 Th17細(xì)胞因子在UC小鼠發(fā)病中的作用

研究已表明Th1/Th2失衡介導(dǎo)的促炎因子與抗炎因子失衡是導(dǎo)致炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的重要發(fā)病機(jī)制［5，6］，T細(xì)胞是免疫調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)，在UC發(fā)病中的作用已成為人們研究的熱點(diǎn)。Th1細(xì)胞以表達(dá)IL－12和IFN－γ為主，介導(dǎo)細(xì)胞免疫;Th2 細(xì)胞以表達(dá) IL－4、IL－5、IL－10 為主，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。Th17是近來發(fā)現(xiàn)的免疫學(xué)領(lǐng)域新因子，為IBD發(fā)病機(jī)制的研究展現(xiàn)了新的前景［7］。CD4+T細(xì)胞是介導(dǎo)腸道炎癥的主要效應(yīng)細(xì)胞，在UC腸道病變局部浸潤且表現(xiàn)出異常的功能狀態(tài)，Th17是CD4+T細(xì)胞的新亞型，其主要形式是 IL－17A，Th17 細(xì)胞分化受 IL－6 和 Stat 3 蛋白調(diào)節(jié)。IL－17 通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)(ERK)－絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路參與調(diào)節(jié)腸上皮屏障功能，IL－17可能是引起腸道炎癥的潛在因素，IL－17A與受體結(jié)合后，通過活化MAP激酶和NF－κB及促進(jìn)趨化因子(如 MCP－1 和 MIP－2)、環(huán)氧合酶－2、組織降解蛋白酶(MMP)等的合成，從而引起炎癥浸潤和組織損傷，并聯(lián)合體內(nèi)適應(yīng)免疫系統(tǒng)和固有免疫系統(tǒng)，介導(dǎo)細(xì)胞外病原體感染、腫瘤、EAE等疾病的發(fā)生發(fā)展。Kobayashi等證實(shí)腸道和淋巴器官中含有IL－17的CD4+T細(xì)胞，在人活動(dòng)性CD和UC的病變腸黏膜的CD3+T細(xì)胞、CD68+單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中可檢測到 IL－17的表達(dá)，其血清中 IL－17 含量同步升高［8］，Th17 細(xì)胞及其分泌的炎癥細(xì)胞因子表達(dá)增加和Th17細(xì)胞功能持續(xù)增強(qiáng)與IBD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［9］。本研究顯示，建模小鼠血清Th17細(xì)胞因子(IL－17A)和IL－6含量明顯升高，而DSS組小鼠升高顯著，且二者呈正性相關(guān)(r=0.913，P＜0.05)，由此結(jié)果推測Th17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在UC疾病發(fā)生發(fā)展中扮演主要作用。

3.3 hEPO對UC小鼠血清Th17細(xì)胞因子和腸道損傷的影響

目前臨床治療UC以糖皮質(zhì)激素、氨基水楊酸制劑、免疫抑制劑等藥物為主，但其長時(shí)間服用不良反應(yīng)多、效果亦欠穩(wěn)定、停藥后易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)使患者失去治愈該病的信心。深入研究UC發(fā)病機(jī)制有利于尋求更為理想和有效的治療藥物，hEPO是一個(gè)多效性細(xì)胞因子，被廣泛應(yīng)用于治療腎病相關(guān)貧血，近年還發(fā)現(xiàn)hEPO可以減輕組織損傷，減少炎性因子產(chǎn)物如 TNF－α、IL－1β、IL－6 等，還能有效改善體液及細(xì)胞免疫功能，調(diào)節(jié) Th1/Th2 平衡等［10－12］，hEPO 的以上特性為其用于治療UC提供了新的視角和指引，與糖皮質(zhì)激素等藥相比有獨(dú)特的優(yōu)勢。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用hEPO治療UC小鼠后，hEPO組小鼠的臨床癥狀、組織病理學(xué)評分均較DSS組改善明顯，血清 IL－6和 IL－17A 水平明顯下降(P ＜0.05)，Th17 細(xì)胞分化減少，腸道炎癥細(xì)胞浸潤減輕，該結(jié)果與Liu等［10］的報(bào)道相一致。

本實(shí)驗(yàn)得出DSS能成功誘導(dǎo)與人UC發(fā)病相似的UC小鼠模型，hEPO可有效下調(diào)UC小鼠體內(nèi)血清IL－6和IL－17A水平，表明hEPO能抑制UC小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)。從Th17分化和調(diào)節(jié)水平看，hEPO可能通過降低血清IL－6水平進(jìn)而減少Th17分化表達(dá)IL－17A、控制腸道炎癥和調(diào)節(jié)過度激活的腸道免疫反應(yīng)從而使UC得到有效治療。hEPO值得我們對其臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)一步探索與研究，以期為UC的治療開辟新的途徑及提供新的藥物選擇。

［1］楊元生，陳 墾，石星亮，等.促紅細(xì)胞生成素的臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.中華全科醫(yī)學(xué)，2009，7(9):992－995.

［2］胡仁偉，歐陽欽，陳代云.右旋葡聚糖硫酸鈉小鼠潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型建立方法探討［J］.胃腸病學(xué)，2002，7(6):331－334.

［3］Okayasu I，Hatakeyama S，Yamada M，et al.A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice［J］.Gastroenterology，1990，98(3):694－702.

［4］Ekstr?m GM.Oxazolone－induced colitis in rats:effects of budesonide，cyclosporin A，and 5－aminosalicylic acid［J］.Scand J Gastroenterol，1998，33(2):174－179.

［5］Holland N，Dong J，Garnett E，et al.Reduced intracellular T－h(huán)elper 1 interferon－gamma in blood of newly diagnosed children with Crohn’s disease and age－related changes in Th1/Th2 cytokine profiles［J］.Pediatr Res，2008，63(3):257－262.

［6］Pang YH，Zheng CQ，Yang XZ，et al.Increased expression and activation of IL－12－induced Stat4 signaling in the mucosa of ulcerative colitis patients［J］.Cell Immunol，2007，248(2):115－120.

［7］葛 婷，唐志鵬，王 亮，等.Th17/Treg失衡與炎癥性腸病的關(guān)系［J］.世界華人消化雜志，2010，18(7):689－694.

［8］Kobayashi T，Okamoto S，Hisamatsu T，et al.IL23 differentially regulates the Th1/Th17 balance in ulcerative colitis and Crohn’s disease［J］.Gut，2008，57(12):1682－1689.

［9］張 毅，儲以微.Th17與自身免疫?。跩］.復(fù)旦學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008，35(1):145－147.

［10］Liu S，Ren J，Hong Z，et al.Efficacy of Erythropoietin Combined With Enteral Nutrition for the Treatment of Anemia in Crohn’s Disease:A Prospective Cohort Study［J］.Nutr Clin Pract，2012.

［11］Tugyan K，Ozbal S，Cilaker S，et al.Neuroprotective effect of erythropoietin on nandrolone decanoate－induced bram injury in rats［J］.Neurosci Lett，2012，pii:S0304－3940(12)01317－1.

［12］Ardalan MR，Estakhri R，Hajipour B，et al.Erythropoietin Ameliorates Oxidative Stress and Tissue Injury following Renal Ischemia/Reperfusion in Rat Kidney and Lung［J］.Med Princ Pract，2012.