NR1I2基因多態(tài)性對(duì)華法林維持劑量個(gè)體差異的影響

鄭綺姍，趙立子，曾武濤，岑菡婧，王雪丁，李嘉麗，冷秀玉，黃 民

(1.中山大學(xué)臨床藥理研究所，廣東廣州 510006;2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管醫(yī)學(xué)部，廣東廣州 510080)

華法林是目前使用最廣泛的口服抗凝藥，但華法林治療窗窄，個(gè)體差異大，臨床上通過檢測國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(International Normalized Ratio，INR)調(diào)整劑量，以減少發(fā)生栓塞或致命性出血。然而，目前國內(nèi)主要采用傳統(tǒng)給藥方案[1]，未能快速達(dá)到預(yù)期治療效果?，F(xiàn)今，國內(nèi)外相關(guān)研究致力于尋找對(duì)華法林維持劑量個(gè)體差異有影響的因素，建立可預(yù)測華法林維持劑量的模型，指導(dǎo)華法林的個(gè)體化用藥。影響華法林維持劑量個(gè)體差異性的因素主要分為臨床因素和遺傳因素兩方面。遺傳因素則包括在華法林作用與代謝過程中起關(guān)鍵作用的受體與酶:維生素K環(huán)氧化物還原酶(vitamin K epoxide reductase，VKOR)、細(xì)胞色素 P450氧化酶(cytochrome P450，CYP)CYP2C9和CYP4F2等，其相應(yīng)基因的遺傳多態(tài)性會(huì)改變受體與酶的活性，影響華法林維持劑量。多項(xiàng)研究顯示VKORC1－1639 G＞A，CYP2C9*2/*3，CYP4F2 rs2108622 C＞T是對(duì)華法林維持劑量個(gè)體差異貢獻(xiàn)較大的3個(gè)因素，相應(yīng)可解釋20%～40%[2]，3%～26%[2－3]與 2%～7%[2，4]的劑量個(gè)體差異。但即使加上臨床因素，目前已建立的華法林維持劑量預(yù)測模型也只能解釋30%～60%的個(gè)體差異[2－4]，仍有大部分的個(gè)體差異未能得到解釋。因此探索新的影響因素對(duì)華法林個(gè)體化用藥有著重要的臨床意義，而核受體是其中極具研究意義的對(duì)象之一。

孕烷 X 受體(pregnane X receptor，PXR)由NR1I2基因編碼，可調(diào)控CYP酶、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體和膽汁酸的表達(dá)[5]。NR1I2的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)對(duì)CYP3A4表達(dá)的影響已有報(bào)道，其中位于上游的NR1I2－25385 C＞T與CYP3A4的表型相關(guān)，位于5號(hào)內(nèi)含子的NR1I27635 G＞A則與CYP3A4的蛋白量相關(guān)，且二者在亞洲人中突變頻率為20%～40%[6]，突變較常見，是影響PXR調(diào)控CYP3A4的重要SNPs。然而，目前尚未見 NR1I2相關(guān) SNPs對(duì) CYP2C9以及NR1I2與華法林維持劑量個(gè)體差異相關(guān)性的報(bào)道。

本課題組前期已進(jìn)行華法林維持劑量與CYP2C9*3，VKORC1－1639 G＞A，CYP4F2 rs2108622 C＞T相關(guān)聯(lián)的研究，VKORC1－1639 G＞A，CYP2C9*3分別解釋 40.1%，26.3%的個(gè)體差異[2]。但華法林維持劑量仍有將近一半的個(gè)體差異未能得到解釋，劑量預(yù)測模型還有很大的待完善空間。本研究以VKORC1－1639 G＞A，CYP2C9*3不同基因型分組，排除此二者對(duì)劑量的影響后，進(jìn)一步探究NR1I2－25385 C＞T，NR1I27635 G＞A對(duì)華法林維持劑量的影響。

1 材料與方法

1.1 受試對(duì)象

共納入2008年3月至2009年12月期間在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院進(jìn)行復(fù)查的機(jī)械瓣膜置換術(shù)后患者179名。均經(jīng)抗凝治療一個(gè)月以上，肝腎功能指標(biāo)正常;使用華法林三個(gè)月以上且期間連續(xù)測得INR值都在1.5～3.0范圍內(nèi)。本研究獲得中山大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選患者均已閱讀并簽訂知情同意書。

1.2 試劑與儀器

CoaguChek?康固全凝血監(jiān)測儀(瑞典Roche公司)，引物(中國 Sangon公司)，ExTaqTM酶系統(tǒng)、限制性內(nèi)切酶(日本TaKaRa公司)，Eppendorf MasterCycler? epGradient PCR儀(德國 Eppendorf公司)，EC3凝膠成像系統(tǒng)(美國 UVP公司)，ABI 3730xl DNA Analyzer測序儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.3 華法林維持劑量的測定

在本研究中，INR為患者定期復(fù)診時(shí)使用凝血監(jiān)測儀快速測定而得，根據(jù)使用說明，抽取患者約100 μl外周血，滴在嵌入在監(jiān)測儀上的專用試紙上，1 min內(nèi)即可讀出INR值;記錄相應(yīng)的檢測日期及INR值。華法林劑量則通過查閱患者的醫(yī)院電子病歷中的藥物開具情況，以及回訪而得;記錄患者每次復(fù)診的日期及開具的華法林劑量，觀察其調(diào)整情況，追蹤其何時(shí)達(dá)穩(wěn)。滿足連續(xù)三個(gè)月以上華法林劑量不變，且INR值在1.5～3.0范圍內(nèi)的，此時(shí)的劑量方為維持劑量。

1.4 基因組DNA提取

參照并優(yōu)化Loparev等[7]的方法。(1)取EDTA抗凝全血 100 μl，加無菌雙蒸水 200 μl混勻;(2)加入 6 mol·L－1NaI 200 μl，混勻;(3)加入氯仿/異戊醇(24∶1)400 μl，混勻，靜置 10 min，于10000 × g離心10 min，吸取上清液至另一離心管;(4)向上清液加入異丙醇 300 μl，混勻，靜置 3 min，于 10000 × g離心 10 min，棄上清;(5)加入 70% 乙醇 500 μl，10000×g離心3 min，棄乙醇;(6)重復(fù)步驟(5)一次，倒置片刻;(7)管壁晾干后，加入TE緩沖液40 μl溶解DNA，－80℃保存。

1.5 基因檢測方法的建立與驗(yàn)證

基因型的檢測，CYP2C9*3和VKORC1－1639 G＞A使用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP);NR1I2－25385 C＞T，NR1I27635 G＞A使用直接測序法，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，引物見表1。

Tab.1 Primers and restriction enzymes for the target SNPs

所有SNPs的PCR體系為:DNA 50 ng，10×Taq緩沖液(buffer)2.5 μl，dNTPs(0.25 mmol·L－1)2 μl，上下游引物 10 μmol·L－1各 1 μl，ExTaqTM0.75 U，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足至 25 μl。

PCR-RFLP酶切體系及條件如下:CYP2C9*3:10× 緩沖液 2 μl，限制性內(nèi)切酶 5 U，PCR 產(chǎn)物10 μl，補(bǔ)足滅菌雙蒸水至 20 μl;37℃孵育 3 h，3% 瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切圖譜。VKORC1－1639 G＞A:10 × 緩沖液 2 μl，BSA 2 μl，限制性內(nèi)切酶 5 U，PCR產(chǎn)物10 μl，補(bǔ)足滅菌雙蒸水至20 μl;37℃孵育5 h;2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切圖譜。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用分層分析法考察NR1I2－25385 C＞T和NR1I27635 G＞A對(duì)華法林維持劑量個(gè)體差異的影響，因此將分別組合固定VKORC1－1639 G＞A與CYP2C9*3的基因型，在不同的組合基因型組內(nèi)分析NR1I2－25385 C＞T，NR1I27635 G＞A對(duì)華法林維持劑量的影響。采用 ANOVA及 t檢驗(yàn)對(duì)NR1I2－25385 C＞T，NR1I27635 G＞A在各組合基因型組內(nèi)的基因型間log劑量進(jìn)行比較。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件分析。由于華法林劑量呈偏態(tài)分布，先對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，使用t檢驗(yàn)及ANOVA對(duì)基因型間維持劑量進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 受試對(duì)象的一般情況

本研究共納入179名機(jī)械瓣膜置換術(shù)后患者，男79 例(44.6%)，女 100 例(55.4%);年齡 17～77歲，年齡(45.0±12.4)歲;身高(161.7±7.5)cm;體質(zhì)量(55.7±9.6)kg;BSA(1.54±0.15)m2;109 例患者使用國產(chǎn)華法林，占60.8%，70例患者使用進(jìn)口華法林，占39.2%，INR 值為2.13±0.27;華法林維持劑量的幾何均數(shù)為(2.85±0.94)mg，最低劑量為1.1 mg，最高劑量為 8.75 mg。

2.2 基因型分布頻率

179名患者中，NR1I2－25385 C＞T CC基因型112例(62.6%)，CT 基因型56 例(31.3%)，TT 基因型11例(6.1%);NR1I27635G＞A GG基因型55例(30.7%)，GA 基因型88 例(49.2%)，AA 基因型36例(20.1%)。VKORC1－1639G＞A GG基因型有4例(2.2%)，GA 基因型 40 例(22.3%)，AA 基因型135例(75.4%);CYP2C9*3有 CYP2C9*1*1型161 例(89.9%)，CYP2C9*1*3 型17 例(9.5%)，CYP2C9*3*3型1例(0.6%)。以上各基因型均符合Hardy-Weinberg平衡;分布頻率在性別之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

2.3 NR1I2－25385 C＞T，NR1I27635 G＞A 對(duì)華法林維持劑量的影響

179名機(jī)械瓣膜置換術(shù)患者中，各SNP對(duì)華法林維持劑量的影響見表2。

如表2所示，攜帶NR1I2－25385C＞T各基因型組患者的華法林維持劑量分別為:CC型(3.0±1.2)mg、CT 型(3.0±1.2)mg、TT 型(2.8±0.8)mg，各基因型組間華法林維持劑量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。攜帶NR1I27635 G＞A各基因型組患者的華法林維持劑量，從野生型、突變雜合子、突變純合子組依次增加，分別為:GG 型(2.7±1.0)mg、GA 型(3.1±1.1)mg、AA 型(3.1±1.4)mg，組間劑量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);兩兩比較結(jié)果顯示，GG基因型組與GA，AA基因型組間維持劑量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，GG基因型組的維持劑量均比GA，AA基因型組低，而GA基因型與AA基因型組間劑量差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 VKORC1－1639 G＞A和CYP2C9*3對(duì)華法林維持劑量的影響

攜帶VKORC1－1639 G＞A各基因型組患者的華法林劑量:GG 型(5.8±1.3)mg、GA 型(3.8±1.3)mg、AA 型(2.6±0.8)mg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);CYP2C9*3將CYP2C9*1*3與CYP2C9*3*3合并，華法林維持劑量在CYP 2 C 9*1*1組、CYP2C9*1*3及CYP2C9*3*3組中分別為(3.1±1.1)mg，(2.1±0.6)mg，兩組的維持劑量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

Tab.2 Mutation frequency of SNPs and their impact on warfarin maintenance dose

2.5 NR1I2－25385 C＞T和NR1I27635 G＞A對(duì)攜帶相同VKORC1－1639和CYP2C9*1*1患者的華法林維持劑量的影響

本課題前期研究結(jié)果[2]及本次研究初步分析結(jié)果，均顯示VKORC1－1639 G＞A及CYP2C9*3對(duì)華法林維持劑量個(gè)體差異貢獻(xiàn)最大，在初步分析時(shí)極可能作為混雜因素干擾NR1I2－25385 C＞T及NR1I27635 G＞A對(duì)華法林維持劑量的真正影響;因此進(jìn)一步采用分層分析，即分別固定VKORC1－1639 G＞A及CYP2C9*3的基因型，進(jìn)行組合分組，考察不同分組中NR1I2－25385 C＞T及NR1I27635 G＞A對(duì)維持劑量的影響。

2.5.1 NR1I2－25385 C＞T 對(duì)攜帶 VKORC1－1639和CYP2C9*1*1患者的華法林維持劑量的影響

NR1I2－25385 C＞T各基因型對(duì)華法林維持劑量的影響見圖1和表3。

僅考察例數(shù)較多的VKORC1－1639 G＞A的GA基因型(n=40)及 AA基因型(n=135)，CYP2C9*3的*1*1基因型(n=161)組合的分組:CYP2C9*1*1/VKORC1－1639GA，CYP2C9*1*1/VKORC1－1639AA。圖1及表3中，NR1I2－25385 C＞T在CYP2C9*1*1/VKORC1－1639 GA和CYP2C9*1*1/VKORC1－1639 AA中，CT基因型與TT基因型的例數(shù)分別為9與1，41與8，將突變雜合子CT與突變純合子TT合并，再與野生型CC作比較，考察野生型CC組與突變等位基因T攜帶CT+TT組的維持劑量。由圖1及表3結(jié)果可知，NR1I2－25385 C＞T野生型 CC組與突變等位基因T(CT+TT)組的維持劑量，CYP2C9*1*1/VKORC1－1639 GA和CYP2C9*1*1/VKORC1－1639 AA，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig.1 Effect of NR1I2－25385 C＞T genotypes on maintenance warfarin dose in patients with VKORC1－1639GA(A)and VKORC1－1639AA(B).

2.5.2 NR1I2 7635 G＞A 對(duì)攜帶 VKORC1－1639和CYP2C9*1*1患者的華法林維持劑量的影響

由圖2及表3所示，NR1I27635 G＞A在攜帶相同CYP2C9*1*1/VKORC1－1639GA亞組中，各基因型GG，GA，AA的例數(shù)分別為9，21，1，將GA與AA組合并，野生型GG組與攜帶突變等位基因A GA+AA組的維持劑量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但GA+AA組(4.2±1.3)mg比 GG 組(3.6±1.4)mg維持劑量要高;在CYP2C9*1*1/VKORC1－1639AA患者中，NR1I27635 G＞A各基因型，其中GA，AA基因型組的維持劑量(2.7±1.0)mg、(2.9±1.0)mg分別與GG基因型組(2.3±1.0)mg相比，均比GG基因型組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而GA與AA基因型組間差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示NR1I27635 G＞A的突變等位基因A攜帶患者須上調(diào)華法林維持劑量。

Tab.3 Effect of NR1I2－25385 C＞T，NR1I27635 G＞A on warfarin manitenance dose in patients with CYP2C9*1*1/VKORC1－1639GA and CYP2C9*1*1/VKORC1－1639AA

進(jìn)一步考察VKORC1－1639 GA/CYP2C9*1*1組與 VKORC1－1639 AA/CYP2C9*1*1組，分析其中NR1I2－25385 C＞T與NR1I27635 G＞A各基因型的劑量關(guān)系，發(fā)現(xiàn):NR1I27635 G＞A在VKORC1－1639 AA/CYP2C9*1*1組中，仍然是GG型比A等位基因攜帶者低(P＜0.05)，而GA型與AA型劑量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;(圖2B);然而在VKORC1－1639 GA/CYP2C9*1*1組中，雖然GG型與GA型的劑量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但呈現(xiàn)GG型劑量低的趨勢(圖2A)。NR1I2－25385 C＞T在兩個(gè)亞組中各基因型的劑量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1A，B)。

Fig.2 Effect of NR1I27635 G＞A genotypes on warfarin maintenance dose in patients with VKORC1－1639 GA(A)and with VKORC1－1639 AA(B).

3 討論

PXR作為CYP酶的調(diào)控因子，目前國內(nèi)外尚無研究將其作為影響華法林維持劑量個(gè)體差異的因素進(jìn)行考察。已有研究多集中在華法林抗凝通路中其他的酶、受體的遺傳多態(tài)性上，如GGCX，EPHX1，CALU，PROC和APOE等;但眾多研究顯示這些因素對(duì)模型的貢獻(xiàn)很低，甚至無貢獻(xiàn)[10]，因此新影響因素，尤其通路以外與相關(guān)基因表達(dá)的上下游調(diào)控因素很值得研究。PXR作為眾多CYP酶表達(dá)的上游調(diào)控因子，其基因多態(tài)性很可能會(huì)通過改變其對(duì)CYP2C9的誘導(dǎo)，從而解釋部分華法林維持劑量個(gè)體差異。本研究首次將NR1I2中對(duì)CYP2C9誘導(dǎo)影響可能性較大的位點(diǎn)與華法林維持劑量相關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示NR1I27635 G＞A野生GG型的華法林維持劑量比A等位基因攜帶者要低，在分層考慮VKORC1－1639 G＞A，CYP2C9*3等較大因素的影響后，仍然保持此趨勢，呈現(xiàn)NR1I27635 G＞A突變后PXR對(duì)CYP2C9誘導(dǎo)增強(qiáng)，提示NR1I27635 GA/AA基因型需上調(diào)華法林劑量，在維持劑量預(yù)測模型中有正向貢獻(xiàn)。然而有研究表明NR1I27635 AA型與GG型相比，可降低利福平對(duì) CYP3A4的誘導(dǎo)[8];雖然CYP2C9與CYP3A4有相似的經(jīng)PXR/CAR誘導(dǎo)的特征[6]，但PXR遺傳多態(tài)性對(duì)CYP2C9的誘導(dǎo)影響是否與其對(duì)CYP3A4誘導(dǎo)有相似的趨勢，目前仍未見報(bào)道。因此，本研究在推進(jìn)指導(dǎo)華法林用藥個(gè)體化的同時(shí)，也為相關(guān)PXR誘導(dǎo)CYP2C9機(jī)制的研究提供一定的理論依據(jù)。

今后，繼續(xù)探索影響華法林維持劑量個(gè)體差異的新因素，考察它們與華法林維持劑量的相關(guān)性，完善劑量預(yù)測模型，并以前瞻性研究對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，更好地指導(dǎo)華法林個(gè)體化用藥。

[1]Huang SW，Chen HS，Wang XQ，Huang L，Xu DL，Hu XJ，et al.Validation of VKORC1 and CYP2C9 genotypes on interindividual warfarin maintenance dose:a prospective study in Chinese patients[J].Pharmacogenet Genomics，2009，19(3):226-234.

[2]Cen HJ，Zeng WT，Leng XY，Huang M，Chen X，Li JL，et al.CYP4F2 rs2108622:a minor significant genetic factor of warfarin dose in Han Chinese patients with mechanical heart valve replacement[J].Br J Clin Pharmacol，2010，70(2):234-240.

[3]Yoshizawa M，Hayashi H，Tashiro Y，Sakawa S，Moriwaki H，Akimoto T，et al.Effect of VKORC1－1639 G＞A polymorphism，body weight，age，and serum albumin alterations on warfarin response in Japanese patients[J].Thromb Res，2009，124(2):161-166.

[4]Borgiani P，Ciccacci C，F(xiàn)orte V，Sirianni E，Novelli L，Bramanti P， et al. CYP4F2 genetic variant(rs2108622)significantly contributes to warfarin dosing variability in the Italian population[J].Pharmacogenomics，2009，10(2):261-266.

[5]Cerveny L， Svecova L，Anzenbacherova E，Vrzal R，Staud F，Dvorak Z， et al. Valproic acid induces CYP3A4 and MDR1 gene expression by activation of constitutive androstane receptor and pregnane X receptor pathways[J].Drug Metab Dispos，2007，35(7):1032-1041.

[6]Lamba J， Lamba V， Schuetz E.Genetic variants of PXR(NR1I2)and CAR(NR1I3)and their implications in drug metabolism and pharmacogenetics[J].Curr Drug Metab，2005，6(4):369-383.

[7]Loparev VN， Cartas MA， Monken CE，Velpandi A，Srinivasan A.An efficient and simple method of DNA extraction from whole blood and cell lines to identify infectious agents[J].J Virol Methods，1991，34(1):105-112.

[8]Pautas E，Moreau C，Gouin-Thibault I，Golmard JL，Mahé I，Legendre C，et al.Genetic factors(VKORC1，CYP2C9，EPHX1，and CYP4F2)are predictor variables for warfarin response in very elderly，frail inpatients[J].Clin Pharmacol Ther，2010，87(1):57-64.