MALP－2對(duì)多形核中性細(xì)胞凋亡及其Bax蛋白表達(dá)的影響＊

高 燕，葉迎春，袁 青，周云剛，黃 黎，劉佳佳△

（瀘州醫(yī)學(xué)院：1.免疫學(xué)教研室；2.病原生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州646000）

多形核中性細(xì)胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN，簡(jiǎn)稱中性核細(xì)胞）來(lái)源于骨髓，屬終末分化細(xì)胞，正常生命期限約為24～48 h，這就意味著PMN一旦分化成熟即啟動(dòng)其自發(fā)性凋亡[1]?，F(xiàn)在已知有多種基因參與PMN自發(fā)性凋亡的調(diào)控，其中Bcl－2家族成員在細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[2]。Bax是Bcl－2家族中促凋亡的重要成員之一。Toll樣受體（toll－like receptor，TLR）是一類識(shí)別病原相關(guān)分子模式（pathogen－associated molecular patterns，PAMPs）的模式識(shí)別受體，目前TLRs家族成員中人類有11種，鼠類13種[3]。TLR作為病原體的關(guān)鍵效應(yīng)器，表達(dá)于PMN的表面或內(nèi)部，在機(jī)體感染病原體后或與其相應(yīng)的TLR激動(dòng)劑結(jié)合后，均可導(dǎo)致PMN的活化，從而影響PMN自發(fā)性凋亡的發(fā)生速率，調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展進(jìn)程。巨噬細(xì)胞活化脂肽（macrophage activating lipopeptide－2，MALP－2）是TLR2／TLR6的配體，對(duì)PMN功能具有直接效應(yīng)，是作用于PMN的重要微生物結(jié)構(gòu)識(shí)別體[4]。本研究運(yùn)用TLR激動(dòng)劑——MALP－2（TLR2／6的配體）刺激人PMN，觀察它們對(duì)PMN凋亡和Bax蛋白表達(dá)水平的影響，探索TLR激動(dòng)劑調(diào)節(jié)PMN凋亡過(guò)程中與相關(guān)的Bax蛋白表達(dá)水平關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI－1640培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，MALP－2細(xì)菌鞭毛蛋白（flagellin）購(gòu)自Alexis公司，兔抗人Bax多抗（一抗）購(gòu)自Thermo，羊抗兔IgG－HRP（二抗）購(gòu)自Santa Cruz公司，內(nèi)參3磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔多抗購(gòu)自KPL公司，流式凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 PMN的分離 抽取健康志愿者外周靜脈血，經(jīng)Ficoll密度梯度離心法分離后取PMN層，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)及Wright－Giemsa染色法確保細(xì)胞活力和純度均達(dá)96%以上方可使用。

1.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng) 調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)／mL，分別將加入MALP－2 10 ng／mL作為實(shí)驗(yàn)組，加 入flagellin 100 ng／mL作為陽(yáng)性對(duì)照組，未經(jīng)處理的PMN作為陰性對(duì)照組，各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置37℃、濕度90%、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，按實(shí)驗(yàn)需要收獲不同時(shí)間段細(xì)胞加以分析。

1.2.3 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) 分別收獲上述各組培養(yǎng)8 h PMN，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌；4℃，3%甲醛冰上固定30 min；PBS洗滌棄上清液，轉(zhuǎn)入流式收集管中；加FITC－Annexin V 5μL和PI 2.5μL，混勻后避光冰浴10 min；加Binding buffer 500μL／管；流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞凋亡率，Cell Quest軟件分析。

1.2.4 Western blotting分析 分別收獲上述各組培養(yǎng)8 h的PMN，并提取其總蛋白。15μL總蛋白上樣于12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE）分離，電轉(zhuǎn)移至二氟化樹脂（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%BSA封閉液室溫封閉1 h。一抗（1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜，二抗（1∶1 000）育膜60 min；1∶5 000辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的GAPDH多克隆抗體（內(nèi)參膜）育膜1 h。加入化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)液5 min；于熒光化學(xué)發(fā)光圖像分析儀中進(jìn)行曝光，采用Quantity－one分析系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶的平均密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用one－way ANOVA，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 新鮮分離PMN活性純度鑒定 直接倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞透明，有立體感和折光感，活性好（圖1）；Wright－Giemsa染色后可見(jiàn)細(xì)胞絕大多數(shù)為3～4葉核的PMN，純度高（圖2）。

圖1 PMN（光鏡×400）

圖2 PMN（Wright－Giemsa染色×1 000）

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PMN凋亡率

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PMN凋亡率 陰性對(duì)照組PMN自發(fā)性凋亡的發(fā)生率為22.61±3.31（圖3A）；陽(yáng)性對(duì)照組PMN凋亡的發(fā)生率為53.78±7.00（圖3B）；實(shí)驗(yàn)組MALP－2凋亡的發(fā)生率為17.23±3.39（圖3C）。3組凋亡率統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)表1。

2.3 Western blotting檢測(cè)PMN Bax蛋白的表達(dá) Western blotting檢測(cè)PMN Bax蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖4。

圖4 PMN Bax蛋白的表達(dá)（Western blotting）

3 討 論

PMN除了自發(fā)性凋亡外，還存在多種外界因素（如激素、脂多糖、TNF－α）的作用下，發(fā)生凋亡的加速或延遲[5]。Fukata等[6]研究發(fā)現(xiàn)，PMN的激活、活化和趨化整個(gè)過(guò)程可受TLRs的調(diào)控。TLR信號(hào)可激活固有免疫、刺激抗原特異性免疫反應(yīng)，并引發(fā)炎癥反應(yīng)；促進(jìn)細(xì)胞膜表面表達(dá)相關(guān)免疫分子；促進(jìn)免疫細(xì)胞的成熟和功能化；抗病毒感染；誘導(dǎo)氧化亞氮依賴性殺菌活性；介導(dǎo)全身免疫病理?yè)p傷及其家族間的協(xié)同作用影響免疫應(yīng)答等。在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的TLR家族11個(gè)成員中，TLRl、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6表達(dá)在細(xì)胞表面，專門識(shí)別細(xì)菌產(chǎn)物[7]。flagellin是TLR5的惟一配體，可特異識(shí)別結(jié)合TLR，介導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和器官損害[8－9]。而在所有TLRs中，TLR2識(shí)別的配體可能最多，包括肽聚糖、脂蛋白、支原體、HSP等，但在識(shí)別過(guò)程中需與TLR1或TLR6形成二聚體發(fā)揮作用。MALP－2是TLR2／TLR6的配體，在接觸MALP－2后，PMN獲得激活細(xì)胞狀態(tài)，分泌IL－8和MIP－1β，吞噬能力增強(qiáng)，細(xì)胞表面CD62L表達(dá)下調(diào)。但MALP－2對(duì)休眠PMN的凋亡效應(yīng)施加的只是一個(gè)短期影響，長(zhǎng)期持久的效應(yīng)發(fā)生在MALP－2跨膜轉(zhuǎn)移后。用MALP－2處理后的PMN移動(dòng)增強(qiáng)，也是由于動(dòng)力效應(yīng)而不是趨化作用。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了PMN凋亡率情況，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為17.23±3.39，與陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組比較細(xì)胞凋亡率明顯下降，并且3組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明MALP－2能明顯延遲PMN凋亡的發(fā)生，延長(zhǎng)PMN的生命期限。

Bax蛋白是1993年Oltvai等[10]從表達(dá)Bcl－2的人B細(xì)胞系RLT中鑒定分離出一種新型的蛋白質(zhì)分子，它是Bcl－2家族中第一個(gè)被確認(rèn)有細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用的成員。Bax蛋白可在線粒體膜上形成新的通道、改變?cè)械耐ǖ阑蛘吒淖兙€粒體膜的脂質(zhì)成分或分布，影響線粒體膜的通透性及線粒體膜對(duì)其他影響因子的反應(yīng)性，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡[11]。在PMN抗／促凋亡基因的平衡調(diào)節(jié)中，Bax和Bcl－2兩種基因相互制約，形成細(xì)胞凋亡的正負(fù)調(diào)控。然而，Bcl－2蛋白質(zhì)家族促凋亡和抗凋亡成員調(diào)控細(xì)胞凋亡作用的具體機(jī)制到目前還不清楚，它可能是一個(gè)非常復(fù)雜的相互作用的體系。隨著對(duì)Bcl－2家族研究的深入，更多的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因?qū)?huì)被發(fā)現(xiàn)，人們可以進(jìn)一步地認(rèn)識(shí)細(xì)胞編程死亡的本質(zhì)及其調(diào)控機(jī)制。因此，對(duì)Bax及Bcl－2家族成員的深入了解有著非常重要的意義。本研究將MALP－2作用于PMN后，從蛋白水平運(yùn)用Western blotting技術(shù)檢測(cè)PMN Bax蛋白的表達(dá)是否影響。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組比較，MALP－2對(duì)PMN Bax蛋白的表達(dá)水平有下調(diào)作用，而且實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組比較，Bax蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明不同的TLR激動(dòng)劑對(duì)Bax蛋白的表達(dá)可能表現(xiàn)出抑制作用或促進(jìn)作用，這可能和TLR激動(dòng)劑類型有關(guān)。因此，本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在TLR激動(dòng)劑誘發(fā)的PMN生胞凋亡或修復(fù)與再生的具體作用機(jī)制，將為腦創(chuàng)傷提供新的治療靶點(diǎn)和手段。

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