莪術(shù)醇對(duì)人胃癌細(xì)胞凋亡、MMP2、NO影響的初步探討

徐立春 陳海燕 文 潔 陶亞玲

揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤防治研究中心，江蘇揚(yáng)州 225001

莪術(shù)醇對(duì)人胃癌細(xì)胞凋亡、MMP2、NO影響的初步探討

徐立春 陳海燕 文 潔 陶亞玲

揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤防治研究中心，江蘇揚(yáng)州 225001

目的 初步探討莪術(shù)醇（Curcumol）對(duì)人胃腺癌細(xì)胞（SGC-7901細(xì)胞）凋亡、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2）、一氧化氮（NO）的影響。 方法 將莪術(shù)醇溶于無(wú)水乙醇中，初始濃度為9 mg/mL，設(shè)實(shí)驗(yàn)1、2、3、4、5組，莪術(shù)醇的濃度分別是7.5、15、30、60、120 μg/mL，并以含 1%無(wú)水乙醇的培養(yǎng)液為對(duì)照組。 采用臺(tái)盼藍(lán)（Trypan blue）、噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞的活性及莪術(shù)醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞抑制增殖的影響；用流式細(xì)胞儀 （FACSCalibur）檢測(cè)莪術(shù)醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞的凋亡率；用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)莪術(shù)醇作用于SGC-7901細(xì)胞后，其MMP2的表達(dá)情況；NO試劑盒檢測(cè)莪術(shù)醇作用SGC-7901細(xì)胞后的細(xì)胞培養(yǎng)液上清的NO含量。 結(jié)果30μg/mL的莪術(shù)醇在藥物濃度與抑制腫瘤生長(zhǎng)方面效果較佳，與對(duì)照組比較，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；莪術(shù)醇實(shí)驗(yàn)組能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；莪術(shù)醇實(shí)驗(yàn)組作用細(xì)胞后，其MMP2蛋白表達(dá)明顯下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)研究表明，隨著莪術(shù)醇實(shí)驗(yàn)組濃度的增加，其細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的NO含量逐漸降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 30μg/mL的莪術(shù)醇濃度是最佳藥效組，它能顯著抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖，明顯促進(jìn)腫瘤的細(xì)胞凋亡，顯著抑制MMP2的表達(dá)，降低細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的NO含量，從而發(fā)揮系列抗腫瘤作用。本研究從細(xì)胞分子水平探討莪術(shù)醇治療胃癌可能存在的部分機(jī)制，為臨床應(yīng)用莪術(shù)醇及其衍生物或結(jié)構(gòu)類似物治療胃癌提供理論與試驗(yàn)依據(jù)。

莪術(shù)醇；SGC-7901；凋亡；基質(zhì)金屬蛋白酶；一氧化氮

胃癌在我國(guó)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，手術(shù)是其最有效的治療方法，對(duì)于術(shù)后復(fù)發(fā)失去再次手術(shù)機(jī)會(huì)的及晚期胃癌患者，化療仍是最有效的手段之一，但其療效不盡人意，因?yàn)樵谙麥缒[瘤細(xì)胞的同時(shí)，受其毒副作用影響而表現(xiàn)出較差的預(yù)后。因而尋求一種新的治療方案迫在眉睫。腫瘤的靶向治療基于分子水平，通過(guò)抑制相關(guān)蛋白或基因在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、血管生成等途徑發(fā)揮較強(qiáng)的抗腫瘤作用，且細(xì)胞毒性作用明顯減少，故成為腫瘤治療的新希望。

近年來(lái)，中藥及其有效成分抗腫瘤作用的研究取得很大進(jìn)展。研究顯示，天然藥物及有效成分可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、抑制血管生成、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等發(fā)揮抗腫瘤作用。同時(shí)中藥具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多效應(yīng)、毒副作用低、提高機(jī)體免疫力、不易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)點(diǎn)。莪術(shù)醇（Curcumol）又名姜黃環(huán)奧醇，為具有半縮酮的氫化奧類化合物，為莪術(shù)的提取物——莪術(shù)揮發(fā)油中抗腫瘤活性成分。目前研究發(fā)現(xiàn)莪術(shù)提取物莪術(shù)醇能殺傷腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，有抑制血管生成的作用，且不良反應(yīng)少，有學(xué)者認(rèn)為抑制腫瘤生長(zhǎng)與抑制環(huán)氧化酶2mRNA和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)有關(guān)[1-4]。

本研究以人胃腺癌（SGC-7901）細(xì)胞為研究對(duì)象，采用現(xiàn)代高新技術(shù)從細(xì)胞分子水平探討莪術(shù)醇抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)可能存在的部分機(jī)制，為臨床應(yīng)用莪術(shù)醇及其衍生物或結(jié)構(gòu)類似物治療胃癌提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

①莪術(shù)醇 （純度95%）：揚(yáng)州大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所提供。②RPMI-1640培養(yǎng)基：美國(guó)GIBCO公司；③Annexin VFITC試劑盒：上海晶美生物工程有限公司；④Braford檢測(cè)蛋白含量試劑盒、Mouse Anti-actin、山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP：武漢博士德生物工程有限公司；⑤Rabbit Anti-MMP2：美國(guó)eBioscience公司；⑥NO試劑盒：南京建成生物公司；⑦M(jìn)TT、DMSO：上海生工生物工程有限公司；⑧細(xì)胞株：人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞株由上海細(xì)胞生物所提供。

1.2 方法

1.2.1 將莪術(shù)醇溶于無(wú)水乙醇溶液，其工作濃度中乙醇的最終濃度為1%，設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組莪術(shù)醇的濃度為7.5、15、30、60、120 μg/mL。SGC-7901 細(xì)胞復(fù)蘇后加入 RPMI1640培養(yǎng)液（pH=7.2，10%小牛血清，青霉素及鏈霉素各100 U/mL）后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代一次。用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 采用MTT法檢測(cè)不同濃度組的莪術(shù)醇對(duì)人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞計(jì)數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板，每孔約5 000個(gè)細(xì)胞，設(shè)6個(gè)復(fù)孔，200μL/孔，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后，更換含莪術(shù)醇的培養(yǎng)液，藥物濃度及分組按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行。培養(yǎng)48 h后，于每孔加入20μL四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）溶液（5 mg/mL），置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，終止培養(yǎng)，棄上清，每孔分別加入150μL二甲基亞砜（DMSO），輕輕振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm下測(cè)定各孔的OD值，記錄結(jié)果。

1.2.3 流式細(xì)胞儀（FACSCalibur）檢測(cè)莪術(shù)醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡率的影響。SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)、莪術(shù)醇的藥物濃度及分組同前。然后將乙醇固定的細(xì)胞離心洗滌后去上清，搖勻，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，加入Binding Buffer 500μL懸浮細(xì)胞，加入AnnexinV-FITC 5μL混勻后，加入碘化丙錠（Propidium Iodide，PI）5μL，震蕩混勻，室溫，避光，反應(yīng) 5～15min，用200目尼龍網(wǎng)濾過(guò)后，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡率分析。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，其激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 用Western Blot法檢測(cè)莪術(shù)醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2）表達(dá)的影響。SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)、莪術(shù)醇的藥物濃度及分組同前。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組培養(yǎng)48 h，終止培養(yǎng)。然后從SGC-7901細(xì)胞中提取總蛋白，用Bradford法檢測(cè)蛋白含量，接著進(jìn)行制膠、加樣、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫印跡操作，所得Western條帶應(yīng)用圖像凝膠成像系統(tǒng)存入計(jì)算機(jī)，用Quantity One灰度分析軟件進(jìn)行光密度計(jì)算，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值作為相應(yīng)目的蛋白的表達(dá)量指標(biāo)，每個(gè)樣本重復(fù)3次[5]。

1.2.5 用一氧化氮（NO）試劑盒檢測(cè)莪術(shù)醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量的影響。SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)、莪術(shù)醇的藥物濃度及分組同前。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，再1 000 r/min離心5min，收集上清液。用NO試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)各管吸光度值[6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 莪術(shù)醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響

7.5 ～120 μg/mL莪術(shù)醇處理 SGC-7901腫瘤細(xì)胞 48 h后，莪術(shù)醇抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用隨其濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)組的抑制率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。 見(jiàn)表 1。

表1 莪術(shù)醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)結(jié)果比較（，%）

表1 莪術(shù)醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)結(jié)果比較（，%）

注：與對(duì)照組比較，＊P＜0.05

組別 抑制率對(duì)照組（1%無(wú)水乙醇組）實(shí)驗(yàn)組7.5μg/mL莪術(shù)醇組15μg/mL莪術(shù)醇組30μg/mL莪術(shù)醇組60μg/mL莪術(shù)醇組120μg/mL莪術(shù)醇組0.19±0.12 4.48±0.35＊8.49±0.49＊30.21±0.71＊45.20±0.79＊57.51±1.30＊

2.2 莪術(shù)醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

隨著莪術(shù)醇對(duì)SGC-7901腫瘤細(xì)胞的濃度增加，SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例逐漸增加，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 莪術(shù)醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡率的影響效應(yīng)結(jié)果（，%）

表2 莪術(shù)醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡率的影響效應(yīng)結(jié)果（，%）

注：與對(duì)照組比較，＊P＜0.05

組別 凋亡率對(duì)照組（1%無(wú)水乙醇組）實(shí)驗(yàn)組7.5μg/mL莪術(shù)醇組15μg/mL莪術(shù)醇組30μg/mL莪術(shù)醇組60μg/mL莪術(shù)醇組120μg/mL莪術(shù)醇組5.10±0.21 6.62±0.13＊12.25±0.34＊28.80±0.16＊40.75±0.44＊48.84±0.35＊

2.3 莪術(shù)醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞MMP2表達(dá)的影響

MMP2能降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜成分，使基底膜喪失連續(xù)性，從而破壞局部組織結(jié)構(gòu)達(dá)到侵襲和轉(zhuǎn)移。不同濃度的莪術(shù)醇作用SGC-7901細(xì)胞48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，采用Western Blot檢測(cè)MMP2蛋白的變化。與對(duì)照組比較，不同濃度的莪術(shù)醇作用細(xì)胞后，隨著藥物濃度的增加，與對(duì)照組比較MMP2蛋白表達(dá)均有不同水平的下調(diào)，莪術(shù)醇實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

2.4 莪術(shù)醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量的影響

隨著莪術(shù)醇作用濃度的增加，SGC-7901細(xì)胞的培養(yǎng)液的上清中的NO含量逐漸下降，除7.5μg/mL莪術(shù)醇組外，其他莪術(shù)醇組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 莪術(shù)醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞上清液中的NO含量的影響（，μmol/L）

表3 莪術(shù)醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞上清液中的NO含量的影響（，μmol/L）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別 NO含量對(duì)照組（1%無(wú)水乙醇）實(shí)驗(yàn)組7.5μg/mL莪術(shù)醇組15μg/mL莪術(shù)醇組30μg/mL莪術(shù)醇組60μg/mL莪術(shù)醇組120μg/mL莪術(shù)醇組158.79±7.02 150.06±4.07 137.65±3.55*123.94±2.44*102.95±3.40*78.32±3.88*

3 討論

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，中藥及其有效成分抗腫瘤作用的研究取得很大的進(jìn)展，有研究報(bào)道天然藥物及其有效成分可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、藥物毒性作用、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥、抑制端粒酶活性等方式發(fā)揮抗腫瘤作用。莪術(shù)醇是中藥莪術(shù)中提取的重要成分，目前研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇作為一種有效的抗腫瘤藥物，通過(guò)直接殺傷腫瘤細(xì)胞、增強(qiáng)腫瘤的免疫原性、增強(qiáng)機(jī)體的免疫力、抑制核酸代謝、抑制血管生成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞分化等機(jī)制發(fā)揮作用[7-9]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，莪術(shù)醇抑制胃腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)率分別為：7.5 μg/mL 的莪術(shù)醇組生長(zhǎng)抑制率是（4.48±0.35）%，15 μg/mL生長(zhǎng)抑制率為（8.49±0.49）%，30μg/mL 生長(zhǎng)抑制率為（30.21±0.71）%，60 μg/mL 生長(zhǎng)抑制率為 （45.20±0.79）%，120 μg/mL生長(zhǎng)抑制率為（57.5±1.30）%。從藥效比分析30μg/mL莪術(shù)醇組是最佳抑制腫瘤細(xì)胞增殖的濃度。

細(xì)胞凋亡是由死亡信號(hào)誘發(fā)的受調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡過(guò)程，是生理性死亡的普遍形式。凋亡過(guò)程中DNA發(fā)生片段化，細(xì)胞皺縮分解成凋亡小體，被鄰近細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬，不發(fā)生炎癥。與細(xì)胞壞死的區(qū)別是，壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無(wú)序變化的死亡過(guò)程，其表現(xiàn)為細(xì)胞長(zhǎng)大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞技術(shù)來(lái)進(jìn)行凋亡分析，其原理是在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，Annexin V與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合，碘化丙啶（PI）不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，能透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V和PI匹配使用，可將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。本實(shí)驗(yàn)用流式細(xì)胞技術(shù)來(lái)檢測(cè)莪術(shù)醇對(duì)SGC-7901細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，結(jié)果是：7.5μg/mL的莪術(shù)醇組其細(xì)胞凋亡率是 （6.62±0.13）%，15μg/mL時(shí)其凋亡率為 （12.25±0.34）%，30 μg/mL 時(shí)其凋亡率為 （28.80±0.16）%，60 μg/mL 時(shí)凋亡率為（40.75±0.44）%，120 μg/mL 凋亡率為（48.84±0.35）%，從這組數(shù)據(jù)中可以觀察到SGC-7901細(xì)胞隨著莪術(shù)醇藥物濃度的增加，其細(xì)胞的凋亡比例顯著增加，呈藥物劑量依賴性。從藥物濃度與凋亡作用效果分析，30μg/mL莪術(shù)醇組是最佳濃度組[10-12]。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是需要腫瘤細(xì)胞和腫瘤基質(zhì)成分共同參與的主動(dòng)過(guò)程，包括腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，細(xì)胞外基質(zhì)的降解，腫瘤細(xì)胞穿透并進(jìn)入鄰近組織[13]。腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生多種蛋白水解酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，因基質(zhì)金屬蛋白酶幾乎能降解細(xì)胞外所有成分，故被認(rèn)為是該過(guò)程中主要的蛋白水解酶?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞突破細(xì)胞外基質(zhì)的組織學(xué)屏障，向鄰近組織侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分和胞外蛋白，故被認(rèn)為是侵襲過(guò)程中的主要的蛋白水解酶，其家族成員具有相似的結(jié)構(gòu)，一般由5個(gè)功能不同的結(jié)構(gòu)域組成。MMPs成員在上述結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上各有特點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌中的MMP2的表達(dá)，可能是促使腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的重要因素，故可作為判斷腫瘤惡性程度的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western Blot檢測(cè)莪術(shù)醇作用于SGC-7901細(xì)胞后的MMP2的表達(dá)水平，觀察發(fā)現(xiàn)不同濃度的莪術(shù)醇作用于SGC-7901細(xì)胞后，隨著濃度的增大，MMP2蛋白表達(dá)水平明顯降低，呈劑量依賴性，筆者認(rèn)為其機(jī)制可能是莪術(shù)醇通過(guò)下調(diào)SGC-7901細(xì)胞中的MMP2蛋白表達(dá)水平，保護(hù)了基底膜的完整性，從而降低SGC-7901細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力[14-15]。

NO在機(jī)體內(nèi)以L-精氨酸為底物，在一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）催化作用下生成。腫瘤來(lái)源的NO在腫瘤細(xì)胞的增殖、生存、轉(zhuǎn)移和侵襲方面表現(xiàn)為介導(dǎo)作用。NO對(duì)腫瘤的作用，有學(xué)者認(rèn)為是促進(jìn)，也有學(xué)者認(rèn)為是抑制，這種矛盾的存在成了NO研究的熱點(diǎn)。在腫瘤早期，NO可通過(guò)介導(dǎo)DNA損傷來(lái)參與腫瘤的形成過(guò)程，它通過(guò)誘導(dǎo)血管生成、刺激腫瘤細(xì)胞的侵襲性和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)來(lái)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)采用一氧化氮試劑盒測(cè)定培養(yǎng)液上清中的NO含量，其原理是NO化學(xué)性質(zhì)活潑，在體內(nèi)代謝很快轉(zhuǎn)化為NO2和NO3，而NO2又進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為NO3-，NO2-的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，是利用硝酸還原酶特異性將NO3-還原為NO2-，通過(guò)顯色深淺測(cè)定其濃度的高低。本實(shí)驗(yàn)采用一氧化氮試劑盒來(lái)檢測(cè)莪術(shù)醇作用于SGC-7901細(xì)胞后，其細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NO含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)莪術(shù)醇抑制了SGC-7901細(xì)胞的的NO的產(chǎn)生，與顧建華等證實(shí)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶選擇性抑制劑氨基胍（AG）抑制鼠胃癌MFC細(xì)胞NO產(chǎn)生發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖作用的結(jié)論相同。所以本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)的單一環(huán)境中，莪術(shù)醇與SGC-7901胃癌細(xì)胞共同孵育的前提下，莪術(shù)醇抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的同時(shí)對(duì)NO也有抑制作用。隨著莪術(shù)醇藥物濃度組的增加，NO含量降低，從15μg/mL組到120μg/mL組的組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，研究結(jié)果表明莪術(shù)醇通過(guò)量-效依賴性關(guān)系阻斷NO產(chǎn)生，從而拮抗NO促瘤作用發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[16-19]。

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)研究顯示莪術(shù)醇抑制了SGC-7901細(xì)胞中的MMP2的表達(dá)，同時(shí)降低了SGC-7901細(xì)胞的培養(yǎng)液上清中的NO含量，筆者認(rèn)為：①可能是莪術(shù)醇抑制了MMP2破壞基底膜的Ⅳ型膠原，保護(hù)了基底膜的完整性，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；②莪術(shù)醇作用于SGC-7901細(xì)胞后通過(guò)下調(diào)NO的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)MMP2和其抑制劑TIMP2、TIMP3之間的平衡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；③莪術(shù)醇作用于SGC-7901細(xì)胞后通過(guò)下調(diào)NO的產(chǎn)生，并以劑量依賴方式來(lái)拮抗NO促瘤作用，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。有關(guān)莪術(shù)醇抗腫瘤的作用機(jī)制的深入研究正在探索之中。

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Prelim inary discussion on effect of curcumol in apoptosis,MMP2 and NO in SGC-7901 cells

XU Lichun CHEN Haiyan WEN Jie TAO Yaling
Cancer Prevention Research Center,Medical College of Yangzhou University,Jiangsu Province,Yangzhou 225001,China

Objective To discuss the effects of Curcumol on the apoptosis,MMP2 and NO of human gastric cancer cells(SGC-7901 cells).MethodsCurcumolwas dissolved in dehydrate alcohol and the initial concentration of Curcumolwas 9 mg/mL.Group 1,group 2,group 3,group 4 and group 5 were set up as experimental groups.The Curcumol concentrations were set as follows:7.5,15,30,60,120μg/mL,control group contained 1%dehydrate alcohol(dissolvent compare).The Trypan blueand method was used to analyze the cytoactive of SGC-7901;MTT assay was performed to study the inhibitory rate of SGC-7901 cells proliferation;the metastasis of SGC-7901 was described through the scratches experiment;the apoptosis rate were detected by FACSCalibur and the expression of Matrixmetalloproteinase 2 (MMP2)were detected by Western Blot.The content of NO in cell culturemedium was detected by NO kit.ResultsCurcumol had a good effect on drug concentration and restrain the tumor growth in 30μg/mL,and compared with controls,it had significant difference in restrain the proliferation of tumor cell(P<0.05);Curcumol could promote the apoptosis,it showed significant difference when compared with controls (P<0.05);Curcumol could make the expression of MMP2 protein descend to varying degrees,it had significant difference when compared with controls(P<0.05);this research showed with the increasing of the concentration of curcumol,the content of the NO in the supernate gradually reduced,it had significant difference when compared with controls(P<0.05).ConclusionCurcumol in 30μg/mL is the best efficacy group,it can significantly inhibit the proliferation of SGC-7901 cell,significantly promote the tumor cell apoptosis,significantly inhibit the expression of MMP2,reduce the content of NO in supernate,and express the series antitumor function.This study discusses the possible mechanism of curcumol cure the stomach cancer from cell and molecular level;provide the basis in theory and experiment for clinical application that Curcumol and its derivatives or structure analogues treat stomach cancer.

Curcumol;SGC-7901;Apoptosis;MMP2;NO

R000

A

1673-7210（2012）12（a）-0018-04

江蘇省醫(yī)學(xué)衛(wèi)生重點(diǎn)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：K200511）。

徐立春，研究員，教授，主要從事腫瘤防治基礎(chǔ)與臨床方面的研究。

2012-07-02 本文編輯：馮 婕）