丹參注射液聯(lián)合骨髓干細(xì)胞移植治療腦梗死肢體癱瘓的臨床研究

鄧英光，張紫萍，余 衛(wèi)

腦梗死是常見病、多發(fā)病，提高患者生活質(zhì)量已成為醫(yī)學(xué)研究的重要課題。近年來隨著骨髓干細(xì)胞 (MSC)生物學(xué)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)某些MSC不但能再生其特定細(xì)胞，而且在一定環(huán)境下可轉(zhuǎn)變生成其他組織系統(tǒng)的細(xì)胞，這是20世紀(jì)末MSC領(lǐng)域的突破性進(jìn)展之一［1］。我院神經(jīng)科從2008年9月開始，試用丹參聯(lián)合自體MSC移植，通過新生血管重建動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)和改善血流，修復(fù)缺血組織和損傷的神經(jīng)，從而緩解癱瘓肢體癥狀，改善腦梗死肢體癱瘓患者的不良預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院神經(jīng)內(nèi)科30例腦梗死肢體癱瘓患者。病例納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合全國第四次腦血管會(huì)議制定的《腦血管疾病分類 (1995)》腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］;(2)年齡18～80歲;(3)第1次患腦梗死發(fā)病3d內(nèi)入院，治療2～3周出院;(4)出院時(shí)無意識(shí)障礙，單側(cè)或雙側(cè)肢體肌力＞Ⅰ級(jí)，＜Ⅳ級(jí)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)藥物過敏者;(2)有嚴(yán)重心、肝、腎等疾病者;(3)有嚴(yán)重精神障礙者;(4)難以隨訪者。

1.2 方法

1.2.1 分組 將30例腦梗死肢體癱瘓確診患者 (包括初次確診患者和已接受傳統(tǒng)療法治療無效者)分為丹參治療組 (對(duì)照組)15例，丹參配伍MSC治療組 (治療組)15例。

1.2.2 MSC體外培養(yǎng) 無菌條件局麻下骨穿抽取患者自體50ml新鮮骨髓液，PBS稀釋1倍后，輕輕疊加到50ml Ficol分離液上，在常溫下1500r/min，離心20min，分離出單核細(xì)胞，用加拿大Mesencult培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為(1～5)×106/ml，接種于175cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中 (每瓶15ml)，放置于飽和濕度、37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。3d后更換培養(yǎng)液，棄掉未貼壁的懸浮細(xì)胞，10d后傳代，0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞重新懸浮，按1∶2比例傳代。4d后半量換一次液，7d后0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化收獲細(xì)胞。

1.2.3 MSC的鑒定 MSC的鑒定通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD34、CD45、CD73、CD90、CD105的表達(dá)，MSC 的特點(diǎn)是，并同時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)菌污染指標(biāo)。

1.2.4 移植方案 采用靜脈滴注作為移植途徑，根據(jù)收獲的細(xì)胞數(shù)量確定移植次數(shù)，每次為 (1～5)×107個(gè)細(xì)胞。MSC治療組按1、3、5d 3次靜脈輸注MSC，輸注前30～60min靜脈滴注20%甘露醇250ml增強(qiáng)血腦脊液屏障的通透性。

1.2.5 臨床治療方案 對(duì)照組:丹參注射液10ml加入5%葡萄糖溶液250ml中，靜脈滴注，1次/d，連續(xù)14d。治療組在輸注MSC前1d開始連續(xù)使用丹參注射液14d。

1.3 療效評(píng)估

1.3.1 美國國立衛(wèi)生研究院卒中 (NIHSS)量表［3］采用NIHSS評(píng)定患者神經(jīng)功能缺損程度。臨床療效根據(jù)治療前后NIHSS評(píng)分的變化及殘障水平評(píng)定:(1)基本痊愈:NIHSS評(píng)分減少90%～100%，殘障水平0級(jí);(2)顯著進(jìn)步:NIHSS評(píng)分減少46% ～89%，殘障水平l～3級(jí);(3)進(jìn)步:NIHSS評(píng)分減少18%～45%;(4)無變化:NIHSS評(píng)分減少或增加＜18%;(5)惡化:NIHSS評(píng)分增加≥18%;(6)死亡。

1.3.2 比較功能綜合評(píng)定 (FCA)量表 每個(gè)項(xiàng)目滿分6分，最低分1分。本研究選取其中5個(gè)觀測(cè)內(nèi)容 (自我照料、括約肌控制、轉(zhuǎn)移、行走、上下樓梯)，即軀體功能評(píng)定，共分為13個(gè)項(xiàng)目觀測(cè)內(nèi)容，滿分78分，最低分13分。

1.3.3 主要觀察指標(biāo) 以CT血管三維重建和彩色多普勒檢查，觀察動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)和腦梗死區(qū)域血流重建情況;檢查血、尿、便常規(guī)、肝、腎功能、心電圖等，全面了解患者病情。

1.4 安全性評(píng)估 觀察丹參注射液及MSC移植治療期間的不良反應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，兩兩比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NIHSS、FCA量表評(píng)分結(jié)果 兩組治療前與治療后14d和治療后28d NIHSS、FCA量表評(píng)分比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);對(duì)照組治療后14d和18d的NIHSS及FCA分別與治療組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表1)。

2.2 客觀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 治療1個(gè)月后腦血管造影CT三維重建和彩色多普勒檢查示腦梗死區(qū)域有一定數(shù)量的新生側(cè)支血管。

2.3 不良反應(yīng) 治療后患者無發(fā)熱反應(yīng)及其他不適感，血、尿、便常規(guī)、肝、腎功能、心電圖等檢查未見特殊改變。

表1 兩組治療前后NIHSS、FCA比較(±s)Table 1 Comparison of NIHSS and FCA before and after the treatment between two groups

表1 兩組治療前后NIHSS、FCA比較(±s)Table 1 Comparison of NIHSS and FCA before and after the treatment between two groups

注:與同組治療前比較，*P＜0.05;與對(duì)照組比較，#P＜0.05

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3 討論

近年來關(guān)于MSC的生物學(xué)研究表明，MSC具有多向分化潛能，其攜帶了人體全部基因組，可同時(shí)對(duì)骨骼肌、心肌和神經(jīng)系統(tǒng)等受損組織進(jìn)行修復(fù)［4］。MSC中的內(nèi)皮祖細(xì)胞為促血管新生細(xì)胞，能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞而誘導(dǎo)血管形成，使細(xì)胞移植治療缺血性疾病的研究取得了突破性的進(jìn)展［5］。Kalka等［6］試驗(yàn)證明，直接移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (BMSCs)可增強(qiáng)一些缺血性疾病的血管生長，在缺血局部可橫向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，并進(jìn)一步分化形成新生毛細(xì)血管，形成新的側(cè)支，改善患者局部血供。而且Chen等［7］采用腦損傷組織勻漿進(jìn)行體外MSC培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在含有腦損傷組織勻漿的培養(yǎng)環(huán)境下，MSC能產(chǎn)生多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，包括神經(jīng)生長因子 (NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)移植MSC促進(jìn)神經(jīng)再生，改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的生物學(xué)行為提供了分子生物學(xué)證據(jù)。

治療組在脫水、調(diào)控血壓、防止血小板聚集和改善腦供血等腦梗死肢體癱瘓常規(guī)治療基礎(chǔ)下，再用丹參注射液聯(lián)合MSC移植治療，結(jié)果顯示，兩組患者治療后14d和28d時(shí)的NIHSS和FCA評(píng)分均有改善，且治療組的評(píng)分均優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)，這說明丹參注射液聯(lián)合MSC移植治療對(duì)改善腦梗死肢體癱瘓患者的神經(jīng)功能缺失，恢復(fù)患者的部分身體功能，使得患者恢復(fù)到患病前一定的日常生活能力。推測(cè)其機(jī)制可能包括:(1)丹參對(duì)于促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)再生、改善局部微循環(huán)、減輕組織缺血再灌注損傷等方面都具有較好作用。丹參多酚酸鹽是丹參水溶性活性部位，其能夠促進(jìn)單核細(xì)胞合成和分泌VEGF、bFGF，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，推測(cè)丹參多酚酸鹽促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移可能是促血管生成的機(jī)制之一［8］。 (2)MSC的神經(jīng)細(xì)胞分化潛能可產(chǎn)生某種程度的神經(jīng)再生，修復(fù)梗死腦組織［9］，而且MSC具有透過血腦脊液屏障和向病損部位遷移的能力［10］。(3)MSC在腦梗死區(qū)域可產(chǎn)生一系列BDNF和VEGF，起到神經(jīng)保護(hù)和血管再生的作用［7］。但具體的作用機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

培養(yǎng)得到的BMSCs靜脈輸注后，至今未觀察到嚴(yán)重不良反應(yīng)，初步說明此技術(shù)方法是安全的。本組病例數(shù)少，觀察時(shí)間尚短，必須密切關(guān)注安全方面的問題，有待進(jìn)一步進(jìn)行大規(guī)模臨床試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

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