豬原環(huán)病毒2型衣殼蛋白含量與抗原滴度的相關(guān)性研究

朱瑩瑩，榮 俊 (長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

匡紅艷 (長江大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434000)

豬原環(huán)病毒2型衣殼蛋白含量與抗原滴度的相關(guān)性研究

朱瑩瑩，榮 俊 (長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

匡紅艷 (長江大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434000)

將豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白原核表達(dá)工程菌用PBS溶解破碎后，經(jīng)2次50%飽和度硫酸銨沉淀，用Brodford法分別測定不同稀釋度的原核表達(dá)菌破菌液中的蛋白含量，同時(shí)進(jìn)行瓊脂雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)，48h觀察免疫沉淀線，以出現(xiàn)免疫沉淀線的表達(dá)產(chǎn)物最高稀釋倍數(shù)為該抗原的滴度，并由此探討豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白(PCV2-CAP)原核表達(dá)產(chǎn)物中總蛋白含量與抗原滴度之間的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明，AGP最小檢出值為0.255mg(蛋白)/ml，表達(dá)產(chǎn)物總蛋白含量在0.255～0.857mg/ml與以0.5為底的AGP滴度的對數(shù)成正相關(guān)關(guān)系(R2=0.9938)。當(dāng)總蛋白含量超過0.857mg/ml時(shí)抗原滴度變化不再相關(guān)聯(lián)?？梢姡?AGP能檢出表達(dá)產(chǎn)物中總蛋白的最低值為0.255mg/ml，最高值為0.857 mg/ml，在此區(qū)間內(nèi)蛋白含量與AGP滴度成正相關(guān)關(guān)系，可以通過測定蛋白含量估算抗原滴度。

豬圓環(huán)病毒2型；蛋白含量；滴度；瓊脂雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV2)由Clark等于1997年從加拿大西部患有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬群中分離得到。該病毒是一種致病性的DNA單鏈病毒，與豬皮炎、腎病綜合征、先天性震顫、后期流產(chǎn)和滲出性皮炎等疾病密切相關(guān)[1]，已對全球養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此對該病毒疫苗的研究具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。疫苗制備過程中抗原含量的確定是保證免疫效果、防止疫苗本身副反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而采用免疫學(xué)方法進(jìn)行抗原滴度的檢測需要較長的時(shí)間或?qū)ｉT的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑，不便于及時(shí)掌握抗原的含量。為此，本研究采用Brodford法測量表達(dá)產(chǎn)物中蛋白含量，探討了蛋白含量與抗原滴度的相關(guān)性，以期采用蛋白含量估算抗原滴度，為疫苗配制過程中抗原量的調(diào)配提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

抗血清：由試驗(yàn)豬免疫獲得；豬圓環(huán)病毒衣殼表達(dá)蛋白：經(jīng)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)獲得；考馬斯亮藍(lán)G250；標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA 1mg/ml。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取18支試管分成6組編號，每組3個(gè)重復(fù)。將各組試管按表1依次加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白和G250混勻，放置5min后，在595nm波長下測定各管光密度。每組以3個(gè)重復(fù)的測定值的平均值作為該組蛋白的光密度。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以光密度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[2-5]，得其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.1056x+0.5397(R2= 0.9902，圖1)。

表1 各試劑加入量與蛋白濃度

圖1 蛋白濃度與光密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2硫酸銨粗純化蛋白液的配制

將收集到的原核表達(dá)豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白(目的蛋白約含30%)用PBS按重量體積比1∶30溶解，加入固體硫酸銨，飽和度為50%，4℃放置1h，10000r/min離心30min，棄上清，蛋白沉淀用原體積PBS溶解，再次用50%硫酸銨沉淀，PBS復(fù)溶蛋白沉淀(純度約50%)。

1.2.3不同稀釋度蛋白液的光密度測定與蛋白濃度計(jì)算

采用Brodford法測量蛋白含量。先將硫酸銨粗純化蛋白液分別用PBS按照8∶2,6∶4,4∶6,2∶8,1∶9,1∶19的比例稀釋，分別記為：原稀釋度蛋白液、80%稀釋度蛋白液、60%稀釋度蛋白液、40%稀釋度蛋白液、20%稀釋度蛋白液、10%稀釋度蛋白液、5%稀釋度蛋白液，隨后分別測量其光密度值，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出各稀釋度蛋白液的蛋白濃度。

1.2.4不同稀釋度蛋白液的抗原滴度檢測

將上述各稀釋度蛋白液采用PBS等倍稀釋，分別從原倍稀釋至1/16后進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)[6-8]。其中周圍孔依次加滿等倍稀釋蛋白液和一個(gè)陰性對照，中間孔加滿抗血清，37℃溫育24～48h，觀察結(jié)果。

1.3 蛋白濃度與抗原滴度相關(guān)性分析

將上述不同稀釋度蛋白液的蛋白濃度與所測定的對應(yīng)的抗原滴度結(jié)合，分析其相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

表2 不同稀釋度蛋白液的光密度與蛋白濃度

2.1 不同稀釋度蛋白液的蛋白濃度

將稀釋的蛋白液分別測定其光密度，求出平均值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度，結(jié)果見表2。

2.2 不同稀釋度蛋白液的抗原滴度

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，原稀釋度蛋白和80%稀釋度蛋白的滴度相同，為1∶8，但前者沉淀線顏色較深(圖2-A、B)，反應(yīng)更充分；10%稀釋度蛋白以后無沉淀線形成，蛋白濃度偏低。

表3 不同稀釋度蛋白液的抗原滴度

A.原稀釋度蛋白液；B.80%稀釋度蛋白液；C.60%稀釋度蛋白液；D.40%稀釋度蛋白液；E.20%稀釋度蛋白液

2.3 瓊脂擴(kuò)散滴度與不同稀釋度的蛋白濃度相關(guān)性

綜合上述蛋白濃度與抗原滴度的數(shù)據(jù)來看，當(dāng)?shù)鞍诐舛仍?.255～0.857mg/ml范圍內(nèi)，蛋白濃度每減少0.2mg/ml，其滴度降低1/2，高于0.857mg/ml抗原滴度上升不再明顯，低于0.255mg/ml則檢測不到抗原(表4)。

圖3 抗原滴度與蛋白濃度關(guān)系

表4不同稀釋度蛋白液的蛋白濃度與抗原滴度

抗原滴度蛋白濃度/(mg/ml)原稀釋度蛋白液1∶80 94480%稀釋度蛋白液1∶80 85760%稀釋度蛋白液1∶40 69140%稀釋度蛋白液1∶20 49220%稀釋度蛋白液1∶10 25510%稀釋度蛋白液-0 1245%稀釋度蛋白液-0 024

以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以log0.5滴度為縱坐標(biāo)作出折線圖(圖3)。由圖3可以看出，蛋白濃度在0.255～0.857mg/ml范圍時(shí)兩者成正相關(guān)，相關(guān)方程為y=4.9564x-1.3437(R2=0.9938)；含量超過0.857mg/ml后滴度達(dá)到上限。

3 討論與小結(jié)

為探討采用蛋白濃度估算抗原滴度的可行性，本研究采用Brodford法，通過測定不同稀釋度蛋白液的光密度求得其蛋白濃度，并通過瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測定了不同稀釋度蛋白液的抗原滴度，分析了蛋白濃度與抗原滴度的相關(guān)性。結(jié)果表明，當(dāng)?shù)鞍诐舛仍?.255～0.857mg/ml范圍時(shí)，兩者成正相關(guān)，相關(guān)方程為y=4.9564x-1.3437(R2=0.9938)，相關(guān)性較好，可以以蛋白濃度估算抗原滴度。而當(dāng)濃度達(dá)到0.857mg/ml時(shí)抗原滴度變化不再明顯，可能原因是抗原濃度過高，需要進(jìn)一步稀釋。

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)雖是一種操作簡單的抗體抗原檢測方法，當(dāng)抗原和抗體呈特異性的結(jié)合且比例適當(dāng)時(shí)，將會(huì)形成抗原抗體復(fù)合物的沉淀，在瓊脂中呈現(xiàn)一條不透明的白色沉淀線，但結(jié)果的判定也需要至24h才能得出，而Brodford法測定蛋白含量數(shù)分鐘就能測出，因此建立這種線性關(guān)系，即在同樣的血清條件下通過試驗(yàn)得出抗原滴度與抗原蛋白的含量能夠快速預(yù)測抗原滴度，為疫苗及時(shí)準(zhǔn)確配制提供了依據(jù)。

[1]Mark A O’Dea,Andrew P Hughes,Linda J Davies,et al.Thermal stability of porcine circovirus type2 in cell culture[J].Journal of Virological Methods，2008,147:61-66.

[2]張龍翔,張庭芳,李令媛,等.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社,1981:164-169.

[3]李 娟,張耀庭,曾 偉,等.應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白含量[J].中國生物制品學(xué)雜志,2000,13(2):118-120.

[4]王孝平,邢樹禮.考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量的研究[J].天津化工,2009,23(3):40-41.

[5]陳曉梅,劉雅文,程 熠,等.考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性觀察[J].中國公共衛(wèi)生,2006,22(3):380-381.

[6]陳茂盛,寇改霞.應(yīng)用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測牛血清BvD/MD抗體[J].中國獸醫(yī)雜志,1994,20(1):25.

[7]李維義,李 媛.應(yīng)用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測新城疫抗原[J].中國畜禽傳染病,1998,20(3):165-167.

[8]朱杰青,吉傳義,陸承平.脫脂奶溶蛋白瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測AhECP[J].微生物學(xué)通報(bào),2000,27(4):286-304.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.04.010

Q939.91

A

1673-1409(2012)04-S037-04

2012-03-11

朱瑩瑩(1986-)，女，湖北武漢人，碩士生，研究方向?yàn)樨i圓環(huán)病毒疫苗。

榮 俊，E-mailrongjun59626@gmail.com。