HPLC法測定血漿中左羥丙哌嗪及藥代動力學(xué)研究

王寶龍，蘭 婷，李明華，張俊娜,李穆瓊，李曉曄，王玉琨(第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系化學(xué)教研室，西安 710032)

HPLC法測定血漿中左羥丙哌嗪及藥代動力學(xué)研究

王寶龍，蘭 婷，李明華，張俊娜,李穆瓊，李曉曄，王玉琨(第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系化學(xué)教研室，西安 710032)

目的：建立一種簡單快速的高效液相色譜法測定左羥丙哌嗪在人血漿中的濃度測定及藥代動力學(xué)研究方法。方法：以迪馬C18(250mm×4.6mm，5μm)為色譜柱，流動相：乙腈∶水(1000ml水加入醋酸2.5ml、三乙胺5ml)=5∶95，流速：1.0m/ml，波長：λex=240nm，λem=350nm，進(jìn)樣量：20 μl，柱溫：35℃。結(jié)果：20名健康受試者單次口服60mg左羥丙哌嗪片，其t1/2為(1.72±0.64)h，tmax為(0.95±0.24) h，Cmax為(385.68±100.98)ng/ml，AUC(0～12h)為(883.32±245.94)ng/h，AUC(0～∞)為 (939.17±279.51)ng/h。結(jié)論：服用該藥后，其藥動學(xué)參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，個體之間、不同年齡、體質(zhì)量之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)。

左羥丙哌嗪；高效液相色譜法；藥代動力學(xué)

左羥丙哌嗪是一類具有手性的藥物。該藥通過對氣管、支氣管C-纖維外周選擇性抑制作用而發(fā)揮鎮(zhèn)咳作用[1]。其作用部位在神經(jīng)結(jié)后與感覺性神經(jīng)肽相關(guān)的位點(diǎn)。本品鎮(zhèn)咳作用強(qiáng)，維持時間長。由于對腎上腺素受體、M膽堿受體和阿片受體均無明顯作用，因此其中樞抑制的不良反應(yīng)較少[2]。口服左羥丙哌嗪吸收迅速，主要分布在支氣管肺部。本品在體內(nèi)被廣泛代謝。35%原型和代謝產(chǎn)物在口服48h內(nèi)從尿排出。主要用于由上呼吸道感染、咽炎、間質(zhì)性肺炎、支氣管哮喘和支氣管炎等呼吸疾病引起的干咳和持續(xù)性咳嗽。

迄今報(bào)道的測定左羥丙哌嗪的方法有HPLC-UV法[3-4]、流動注射發(fā)光法[5-6]、RF-HPLC法[7-9]。本試驗(yàn)在以上熒光法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了條件優(yōu)化，旨在建立測定血漿中左羥丙哌嗪的方法，并對其藥代動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測定。

1 儀器與試藥

1.1儀器

日本島津高效液相色譜儀(型號LC-20AT)，熒光檢測器(型號RF-10AXL)。

1.2試劑

左羥丙哌嗪分散片(生產(chǎn)廠家：昆明源瑞制藥有限公司，規(guī)格：60mg/片，批號：20091201)，甲醇、乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀為pH基準(zhǔn)試劑。

2 方 法

2.1對照品溶液的配制

精密稱取左羥丙哌嗪5mg，置于50ml量瓶中，用甲醇溶解并定容再續(xù)取左羥丙哌嗪1ml，置于10ml量瓶中，用甲醇定容得到10μg/ml的左羥丙哌嗪貯備液。

2.2受試者的選擇

隨機(jī)選擇男性健康受試者20名，年齡(35.3±3.0)歲，身高(169.8±2.9)cm，體質(zhì)量(61.8±2.9)kg。試驗(yàn)前經(jīng)病史詢問、體檢、胸透、心電圖、血及尿常規(guī)、血生化檢查，各項(xiàng)指標(biāo)均正常，受試者無藥物過敏史和藥物依賴史，無精神病史及其他慢性病史。受試前2周及試驗(yàn)期間未服用任何藥物，受試期間禁煙、酒及其他含咖啡因、茶堿等飲料，避免劇烈運(yùn)動。所有受試者自愿參加試驗(yàn)并簽署知情同意書，試驗(yàn)方案經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)。

2.3給藥方法

左羥丙哌嗪正常臨床治療劑量為一次口服60mg，3次/d。鑒于國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道多采用單劑量口服左羥丙哌嗪60mg，為便于與文獻(xiàn)比較，故本試驗(yàn)左羥丙哌嗪的給藥劑量確定為單次口服60mg。

2.4采集血樣

受試者禁食12h后，早晨空腹給藥，用溫開水250ml吞服藥物，服藥后4h進(jìn)統(tǒng)一食譜的標(biāo)準(zhǔn)餐?？诜幬锴俺槿】瞻籽獦?ml，在服藥后的10、20、30、45min，1、1.5、2、3、4、6、8h和12h分別采靜脈血5ml，置無菌肝素抗凝的試管中，離心分離出血漿置無菌試管中，于-20℃保存。

2.5血藥濃度測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：迪馬C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相：乙腈∶水(1000ml加入醋酸2.5ml、三乙胺5ml)=5∶95，流速：1.0ml/ml，波長：λex=240nm，λem=350nm，進(jìn)樣量：20μl，柱溫：35℃。

2.5.2 血漿樣品處理 取樣品血漿1ml置于10ml具塞玻璃離心管中，然后精密加入1mol/L的K2HPO4(pH=8.9) 1.0ml，混合后加入二氯甲烷-乙醚(7∶3) 7ml，渦旋混合3min，離心5min(3000rpm)。取上層有機(jī)層，用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?.4ml蒸餾水溶解并進(jìn)樣。

2.6特異性考察

左羥丙哌嗪對照品、空白血漿、空白血漿加對照品、血漿樣品色譜圖見圖1，左羥丙哌嗪的保留時間大約為11.7min，分離度良好，可確保分析方法的專一性。

圖1 左羥丙哌嗪色譜圖

2.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取1ml空白血漿共9份，依次加入左羥丙哌嗪儲備液0、1、2、5、10、20、40、80μl和100μl制成0、10、20、50、100、200、400、800ng/ml和1000ng/ml的血漿樣品，按2.5.2項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析，以藥物峰面積為縱坐標(biāo)(y)，血藥質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)作回歸分析，得回歸方程：y= 4044.519x+ 85623.377 (r=0.9989)。結(jié)果表明，在10～1000ng/ml線性范圍內(nèi)，左羥丙哌嗪線性關(guān)系良好，按該方法測得的左羥丙哌嗪的血藥質(zhì)量濃度的檢測限為2ng/ml，最低定量限為10ng/ml。

2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取離心管數(shù)支，精密加入1ml空白血漿，再分別精密加入不同量的左羥丙哌嗪溶液，渦旋混勻，配成質(zhì)量濃度為20、200ng/ml和800ng/ml的左羥丙哌嗪血漿若干份，取上述質(zhì)量濃度樣品，分別考察室溫和-80℃冰凍保存30d及反復(fù)凍融之后的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，經(jīng)過室溫放置，-80℃冰凍保存30d及反復(fù)凍融之后，左羥丙哌嗪的濃度基本無變化，RSD值均小于4.2%。

2.9精密度實(shí)驗(yàn)

離心管數(shù)支，于離心管中分別精密加入不同量的左羥丙哌嗪標(biāo)準(zhǔn)液適量，渦旋混勻，配成20、200ng/ml和800ng/ml的左羥丙哌嗪標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣品，每個質(zhì)量濃度做5份樣品，每次做一批并隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，按2.5.2項(xiàng)下操作；連續(xù)分析三批，記錄左羥丙哌嗪峰面積(y)，代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得實(shí)測濃度，測得三個質(zhì)量濃度的批內(nèi)精密度RSD值分別為4.73%、3.28%、1.46%，批間精密度RSD值分別為4.98%、3.10%、4.26%，結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)的分析方法精密度良好。

2.10提取率實(shí)驗(yàn)

取離心管數(shù)支，于離心管中分別精密加入不同量的左羥丙哌嗪對照液，精密加入1ml流動相，渦旋混勻，配成含左羥丙哌嗪質(zhì)量濃度分別為20、200ng/ml和800ng/ml的溶液，按2.5.2項(xiàng)下操作，每種濃度做5份樣品，記錄左羥丙哌嗪峰面積(ys)。

取離心管數(shù)支，于離心管中分別精密加入不同量的左羥丙哌嗪標(biāo)準(zhǔn)液適量，精密加入1ml空白血漿，渦旋均勻，配成20、200、800ng/ml的左羥丙哌嗪血漿樣品，按2.5.2項(xiàng)下操作，每種濃度做5份樣品。記錄色譜圖，記錄峰面積yi，yi和ys之比即為左羥丙哌嗪的提取率。結(jié)果表明，本分析方法的平均提取率大于85%，能作為實(shí)驗(yàn)用的提取方法。

3 結(jié) 果

圖2 健康受試者口服左羥丙哌嗪后的平均血藥濃度時間曲線圖

3.1血藥濃度測試結(jié)果

受試者血漿樣品按2.5.2項(xiàng)下操作，每批樣品測定之前均隨行標(biāo)曲，并在測定時隨機(jī)分配含左羥丙哌嗪質(zhì)量濃度為20、200ng/ml和800ng/ml的質(zhì)控樣品，計(jì)算樣品和質(zhì)控樣品的濃度，根據(jù)質(zhì)控樣品的測定結(jié)果決定當(dāng)日數(shù)據(jù)的取舍，受試者的平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

3.2藥動學(xué)結(jié)果

將受試者的經(jīng)時血藥濃度錄入DAS(ver2.0.1)程序計(jì)算。20名健康受試者口服左羥丙哌嗪后，其消除半衰期t1/2為 (1.72±0.64)h，tmax為(0.95±0.24) h，Cmax為 (385.68±100.98)ng/ml，AUC(0～12h)為 (883.32±245.94)ng/h，AUC(0～∞)為 (939.17±279.51)ng/h。

4 討 論

我們考察了不同流動相對左羥丙哌嗪出峰時間的影響，發(fā)現(xiàn)流動相中磷酸鹽緩沖液濃度的微小變化對樣品出峰時間影響較大，經(jīng)過多次平行實(shí)驗(yàn)，最終確定用文中所述的流動相組成，這樣既保證了樣品能在12min之前出峰，縮短測試時間，又盡可能的減少有機(jī)相的用量，減少對環(huán)境的污染。

在處理血漿方面，之前有文獻(xiàn)報(bào)道用三氯甲烷∶異丙醇=9∶1[7-8]，三氯甲烷[9]作為萃取液提取血漿中的左羥丙哌嗪，但以上方法均要用到毒性較大的三氯甲烷，而我們采用了毒性較小的二氯甲烷，又加入一定量的乙醚作為萃取液，該萃取液體系對左羥丙哌嗪的提取效果好，提取率高，且在萃取時處在血漿的上方，使得進(jìn)行實(shí)驗(yàn)更加方便且污染較小。

在選擇檢測方法方面，我們先選取了紫外法測定左羥丙哌嗪的濃度，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在其最大吸收波長240nm處其吸收比較弱，用此方法檢測的靈敏度低，造成的測量誤差大。最后經(jīng)過篩選，決定用熒光法對其進(jìn)行測定，減少了血漿中雜質(zhì)的干擾，從而提高了左羥丙哌嗪檢測的靈敏度與準(zhǔn)確性。

本實(shí)驗(yàn)建立了RF-HPLC法測定左羥丙哌嗪片劑的方法，并測試了該藥的藥動學(xué)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法分離度高，選擇性好，樣品在-80℃冰凍保存條件下可放置30d，提取回收率大于85%，方法成熟、完善，均有較高的專屬性，可用于左羥丙哌嗪的臨床研究工作。

[1]馮琳. KMnO4-HCHO-EDTA流動注射化學(xué)發(fā)光法測定左羥丙哌嗪[J].江西師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2009，33(3)：279-281.

[2]席志軍，章竹君，孫永華. 高效液相色譜化學(xué)發(fā)光法測定血清中左羥丙哌嗪[J].分析試驗(yàn)室，2009，28(5)：16-19.

[3]鄢琳，李銅鈴，張蓉琴，等. RP-HPLC測定左羥丙哌嗪緩釋片的含量[J].中國藥學(xué)雜志，2004，39(4)：303-304.

[4]呂荊洪,趙亞萍．HPLC法測定 LOD糖漿的含量[J].中國藥師，2002，5 (1)：35-36．

[5]李麗，黃玉明. 流動注射化學(xué)發(fā)光法測定左羥丙哌嗪[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，31(6)：169-172.

[6]李麗，鄭奎玲. Ce(SO4)2-羅丹明6G-左羥丙哌嗪化學(xué)發(fā)光體系的研究[J].貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，25(2)：100-102.

[7]朱運(yùn)貴，肖軼雯，雷志強(qiáng). 左羥丙哌嗪的人體藥動學(xué)研究[J].醫(yī)學(xué)臨床研究，2005，22(11)：1578-1581.

[8]劉金玲. HPLC熒光法研究左羥丙哌嗪的人體藥動學(xué)[J].湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2006，3(2)：42-45.

[9]高洪志，梁宇光，郝光濤，等. 左羥丙哌嗪含片人體藥動學(xué)研究[J].中國新藥雜志，2008，17(16)：1443-1447.

[編輯] 一 凡

R914

A

1673-1409(2012)04-R058-04

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.04.030

2012-03-10

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21172261，21042008)。

王寶龍(1984-)，男，陜西西安人，助教，主要從事藥物合成與分析研究；通訊作者：王玉琨，E-mail：wangyk@fmmu.edu.cn。