添加外源物質(zhì)對(duì)紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶的影響

張聰芝， 葛向陽， 張偉國(guó)

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122）

紅曲霉（Monascus）屬于真菌界（Eumycophyta）、子 囊 菌 門 （Ascomycetes）、 真 子 囊 菌 綱（Euascomycetes）、散子囊菌目（Eurotiales）、紅曲菌科（Monascaceae）、紅曲霉屬（Monascus）[1]。 紅曲霉用途十分廣泛，在釀酒、食品、食品色素和醫(yī)藥等方面都有重要應(yīng)用。近年來，應(yīng)用紅曲霉生產(chǎn)降血脂活性物質(zhì)[2]以及應(yīng)用于白酒酯化增香已成為研究的熱點(diǎn)。白酒中各種風(fēng)味香酯類物質(zhì)的形成與微生物酯化酶密切相關(guān)，沒有酯化酶就沒有酯香濃厚的濃香型大曲酒[3]。酯化酶不是酶學(xué)上的定義，而是白酒行業(yè)的習(xí)慣稱法，酯化酶是羧基酯酶 （Esterase E.C.3.1.1.2）的一種，不同于脂肪酶（Lipase，E.C.3.1.1.3），酯化酶既可以催化形成羧酯鍵又可以水解羧酯鍵[4]。

將紅曲霉酯化酶應(yīng)用于白酒方面的研究已有諸多報(bào)道，研究?jī)H限于菌株選育、發(fā)酵條件優(yōu)化和酯化條件等研究，考察添加外源物質(zhì)對(duì)紅曲霉產(chǎn)酯化酶影響的報(bào)道較為少見，作者探討了添加葡萄糖、新鮮酵母培養(yǎng)物以及乙醇和乳酸等物質(zhì)對(duì)紅曲霉產(chǎn)酯化酶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 紅曲霉HQ-3和釀酒酵母J-1均為作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯 200，葡萄糖 20，瓊脂20，pH自然；種子培養(yǎng)基：同斜面培養(yǎng)基，不加瓊脂；酒精酵母種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨 20，酵母膏 10，pH自然；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮、豆餅粉、稻殼比例為 35∶4∶6，裝量 30 g/500 mL三角瓶，控制含水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，其中發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌條件為：115℃，滅菌10 min；其余均為121℃，滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 酵母培養(yǎng)物制備 釀酒酵母種子培養(yǎng)基的裝液量為50 mL/500 mL三角瓶。刮一環(huán)新鮮酵母于酵母種子培養(yǎng)基中，31℃搖床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min，定時(shí)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，細(xì)胞濃度達(dá)到108個(gè)/mL，停止培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將培養(yǎng)好的釀酒酵母離心，上清液既為酵母濾液，無菌水洗滌菌體后獲得酵母菌體，將部分酵母菌體超聲破碎30 min然后高速離心所得上清液為酵母破壁液。

1.2.2 粗酶制劑制備 將培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的種子液接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，34℃培養(yǎng)4 d，發(fā)酵結(jié)束室溫風(fēng)干12 h，即為紅曲粗酶制劑。

1.2.3 酯化力測(cè)定 采用傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)酯化力測(cè)定方法[5-7]在250 mL圓底燒瓶中，加5 g紅曲粉試樣，精確到1 mg。100 mL體積分?jǐn)?shù)1%己酸的乙醇溶液于32℃酯化100 h。酯化結(jié)束后，加入蒸餾水50 mL，緩火蒸餾出100 mL餾出液。量取50 mL餾出液于250 mL三角瓶中，用NaOH（0.1 mol/L）中和后再加入25 mL NaOH （0.1 mol/L），冷凝回流皂化30 min，皂化結(jié)束后立即冷卻，用H2SO4標(biāo)液 （0.05 mol/L）滴定至pH7.0。

酯化力＝（C1V1-C2V2）/（m×50/V總）×144。式中：C1為 NaOH濃度 （mol/L）；V1為 NaOH消耗體積（mL）；C2為 H2SO4濃度（mol/L）；V2為 H2SO4消耗體積（mL）；V總為餾出液總體積（mL）。

2 結(jié)果與討論

2.1 添加速效碳源對(duì)紅曲霉產(chǎn)酯化酶的影響

在麩皮為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上，紅曲霉要生長(zhǎng)首先自身要產(chǎn)生淀粉酶、糖化酶，分解底物中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為直接利用的糖，供自身利用；彭熙敏[7]研究發(fā)現(xiàn)添加葡萄糖可以促進(jìn)紅曲霉產(chǎn)酯化酶酯化力。在初始培養(yǎng)基30 g固體物料中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%葡萄糖、2%酵母膏和2%酵母粉等考察對(duì)紅曲霉產(chǎn)酯化酶酯化力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加葡萄糖相比另外兩種物質(zhì)能明顯提高酯化力（如圖1），分析認(rèn)為添加葡萄糖作為速效碳源明顯促進(jìn)紅曲霉的前期生長(zhǎng)，菌絲體布滿培養(yǎng)基，為后期產(chǎn)酶奠定了基礎(chǔ)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)速效碳源添加量存在最佳范圍（如圖2），添加太少不能有效促進(jìn)生長(zhǎng)與產(chǎn)酶，添加太多則導(dǎo)致過量長(zhǎng)菌，反而減弱產(chǎn)酶。

圖1 添加物對(duì)紅曲霉產(chǎn)酯化酶的影響Fig.1 Effect of glucose on esterase production by monascus

圖2 葡萄糖添加量對(duì)紅曲霉產(chǎn)酯化酶的影響Fig.2 Effect of glucose concentration on esterase production by monascus

2.2 新鮮酵母培養(yǎng)物對(duì)紅曲霉產(chǎn)酯化酶的影響

2.2.1 不同新鮮酵母培養(yǎng)物的影響 在2.1實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)酵母粉與酵母膏并不能明顯促進(jìn)紅曲霉產(chǎn)酯化酶酯化力；趙樹欣[8]等研究發(fā)現(xiàn)新鮮酵母培養(yǎng)物能促進(jìn)紅曲霉菌體的生長(zhǎng)，促進(jìn)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。在發(fā)酵培養(yǎng)36 h后添加不同的新鮮酵母培養(yǎng)物2 mL發(fā)現(xiàn)酯化力有顯著提高 （如圖3），相比酵母濾液、酵母菌體與酵母破壁液對(duì)酯化力的提高相對(duì)較高，Shin[9]等人研究認(rèn)為新鮮酵母培養(yǎng)物中存在殼聚糖酶，殼聚糖酶能分解紅曲霉細(xì)胞壁，影響菌體形態(tài)，可以促進(jìn)菌體量的增加；新鮮酵母培養(yǎng)物中存在誘導(dǎo)因子，促進(jìn)紅曲霉生長(zhǎng)及代謝活動(dòng)。進(jìn)一步分析認(rèn)為殼聚糖酶能部分分解紅曲霉細(xì)胞壁，有利于胞內(nèi)酯化酶的向外分泌，促進(jìn)酯化力的提高。結(jié)果表明酵母菌體與酵母破壁液促進(jìn)了酯化力的提高，酯化力分別是對(duì)照組的1.29倍、1.30倍。酵母菌體的這種誘導(dǎo)作用，可以將紅曲霉與酵母混菌發(fā)酵產(chǎn)酯化酶，促進(jìn)酯化力的提高，制成多菌種混合強(qiáng)化大曲，不僅可以提高酯化力還可以提高酒精產(chǎn)率；酵母破壁液的這種誘導(dǎo)作用，可以將啤酒廢酵母加以利用，為啤酒行業(yè)廢酵母處理提供了新途徑，可以將啤酒行業(yè)與白酒行業(yè)聯(lián)系起來，促進(jìn)資源優(yōu)化配置。

圖3 添加物對(duì)紅曲霉產(chǎn)酯化酶的影響Fig.3 Effect of fresh yeast lysate on esterase production by monascus

2.2.2 新鮮酵母破壁液添加時(shí)間的影響 分別在接種培養(yǎng)0、1、2、3 d后添加酵母破壁液，發(fā)酵4 d后測(cè)定培養(yǎng)物的酯化力，結(jié)果表明在發(fā)酵1 d時(shí)添加酵母破壁液的酯化力最高達(dá)到97.67 mg/g（如圖4），這說明在菌體初始生長(zhǎng)階段添加誘導(dǎo)物能有效提高紅曲霉產(chǎn)酯化酶活力，分析認(rèn)為在菌絲體生長(zhǎng)到一定階段，誘導(dǎo)劑才能對(duì)菌體產(chǎn)生影響，添加太早菌絲體生長(zhǎng)沒有完成，誘導(dǎo)作用微弱，添加太晚菌絲體老化，誘導(dǎo)作用不大。

圖4 不同時(shí)間添加酵母破壁液對(duì)紅曲霉產(chǎn)酯化酶的影響Fig.4 Effect of the time of add fresh yeast lysate on esterase production by monascus

2.2.3 新鮮酵母破壁液添加量的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基在接種發(fā)酵1 d后分別添加不同量的新鮮酵母破壁液，發(fā)酵4 d后測(cè)定酯化力，結(jié)果表明（如圖5）不同添加量對(duì)紅曲霉產(chǎn)酯化酶酯化力的提高程度不同，添加1 mL/30 g固體物料時(shí)對(duì)酯化力的提高最為顯著，超過1 mL對(duì)酯化力的提高有所降低，分析認(rèn)為酵母破壁液的誘導(dǎo)作用有一定的范圍，在一定范圍內(nèi)可以有效提高酯化酶活力，超過或低于這個(gè)范圍，誘導(dǎo)作用不明顯，另外添加量的增加，將直接影響固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的水分含量，由于酯化酶在低水活度的條件下產(chǎn)酶活力和酯化力較高，水活度的提高對(duì)酯化力的增加有一定影響，但這樣就容易產(chǎn)生浮水現(xiàn)象，容易感染細(xì)菌，影響產(chǎn)酶能力。

圖5 不同酵母破壁液添加量對(duì)紅曲霉產(chǎn)酯化酶的影響Fig.5 Effect of fresh yeast lysate concentration on esterase production by monascus

2.3 添加底物類物質(zhì)對(duì)紅曲霉產(chǎn)酯化酶的影響

許多研究報(bào)道表明，油脂類物質(zhì)可以促進(jìn)霉菌菌體生長(zhǎng)并且促進(jìn)產(chǎn)酶，大多數(shù)的酯化酶屬于誘導(dǎo)型酶，Shimada[10]等人研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈脂肪酸可以促進(jìn)脂肪酶的表達(dá)；與此同時(shí)潘運(yùn)國(guó)[11]研究發(fā)現(xiàn)橄欖油在促進(jìn)根酶產(chǎn)酯化酶方面也有一定作用。據(jù)報(bào)道表面活性劑等相關(guān)物質(zhì)也具有相似的作用。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.5 mL/30 g相關(guān)類物質(zhì)，接種發(fā)酵4 d后測(cè)定酯化力，結(jié)果（如圖6）表明橄欖油與大豆油對(duì)產(chǎn)酶有一定促進(jìn)作用，其中大豆油相比橄欖油效果要好，這與其他研究報(bào)道并不相同；表面活性劑吐溫-80對(duì)產(chǎn)酶促進(jìn)作用明顯，而甘油則有一定抑制作用[12]。分析認(rèn)為一方面酯化酶催化酯合成是可逆的，油脂類物質(zhì)作為底物可以誘導(dǎo)促進(jìn)酯化酶酶量的增加；另一方面脂肪酸類物質(zhì)與表面活性劑可以與菌體細(xì)胞膜發(fā)生相關(guān)作用，對(duì)細(xì)胞膜的通透性有一定作用，從而有利于胞內(nèi)酯化酶的向外分泌，促進(jìn)酯化酶的生成[13]。底物己酸在促進(jìn)產(chǎn)酶方面也具有一定作用，但是效果不顯著，可能是對(duì)己酸耐受性較差，不能有效促進(jìn)酯化力的提高；相比而言乙醇與乳酸的加入對(duì)酯化力的提高有較明顯作用，這與乙醇可以促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，紅曲霉嗜乳酸能以乳酸為碳源相關(guān)，該發(fā)現(xiàn)與唐玉明[14]的報(bào)道相似，紅曲霉的這種作用可以研究與乳酸菌共生提高產(chǎn)酯化酶的能力。

圖6 添加物對(duì)紅曲霉產(chǎn)酯化酶的影響Fig.6 Effect of substrateon esteraseproduction by monascus

3 結(jié)語

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：葡萄糖作為速效碳源，對(duì)紅曲霉的初期生長(zhǎng)具有一定作用，促進(jìn)菌絲體大量積累為后期產(chǎn)酶奠定基礎(chǔ)，使酯化力提高到對(duì)照組的1.20倍達(dá)到98.65 mg/g；添加新鮮酵母培養(yǎng)物對(duì)酯化力的提高有顯著作用，其中酵母破壁液的作用最為明顯，發(fā)酵4 d后酯化力是對(duì)照組的1.30倍達(dá)到106.87 mg/g，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定了最佳添加時(shí)間為發(fā)酵24 h后添加，最佳添加量為1 mL/30 g（以固體物料計(jì)），酵母破壁液的這種誘導(dǎo)作用為啤酒廢酵母利用提供了新的途徑；添加底物類物質(zhì)對(duì)紅曲霉產(chǎn)酯化酶酯化力的提高效果顯著，其中大豆油效果較好是對(duì)照組的1.36倍達(dá)到119.21 mg/g，乙醇與乳酸的加入對(duì)酯化酶酯化力的提高作用相當(dāng)明顯，添加乙醇使酯化力提高到123.32 mg/g。

[1]李鐘慶，郭芳.紅曲霉的形態(tài)與分類[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2003.

[2]邢旺興，程榮珍.幾種常見紅曲霉的生理學(xué)特性研究[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2001，19（4）：231-234.XING Wang-xing，CHENG Rong-zhen.Study on the physiological characteristics of seven ordinary Monascus[J].The Journal of Pharmaceutical Practice，2001，19（4）：231-234.（in Chinese）

[3]杜禮泉，唐聰，古加強(qiáng)，等.紅曲霉酯酶酯化特性的探討[J].中國(guó)釀造，2005（1）：23-24.DU Li-quan，TANG Cong，GU Jia-qing，et al.Exploration to the esterification property of esterase produced by Monascus spp.[J].China Brewing，2005（1）：23-24.（in Chinese）

[4]王耀，范文來，徐巖，等.濃香型大曲中酯化酶測(cè)定方法的研究[J].釀酒，2003，（30）：18-20.WANG Yao，F(xiàn)AN Wen-lai，XU Yan，et al.Study on the determination method about the esterifying enzymes from DaQu of Chinese Strong Flavour Liquor Making[J].Liquor Making，2003，（30）：18-20.（in Chinese）

[5]施安輝，楊軍方，徐海燕，等.紅曲霉的生物學(xué)特性、酯酶培養(yǎng)技術(shù)及質(zhì)量鑒定[J].中國(guó)調(diào)味品，2006，（7）：25-28.SHI An-hui，YANG Jun-fang，XU Hai-yan，et al.Biology characteristics of nonascus and culture technology of esterifying enzymes and qual ity identification[J].China Condiment，2006，（7）：25-28.（in Chinese）

[6]徐希望，王劍方，夏培禹，等.大曲酯化力的測(cè)定方法探討[J].釀酒，2005，（6）：69-70.XU Xi-wang，WANG Jian-fang，XIA Pei-yu，et al.The discussion of the measurement method of Daqu esterification force[J].Liquor Making，2005，（6）：69-70.（in Chinese）

[7]彭熙敏，黃著，劉超蘭，等.紅曲霉培養(yǎng)條件對(duì)酯化力影響的研究[J].釀酒科技，2009，（1）：17-20.PENG Xi-min，HUANG Zhu，LIU Lan-Chao，et al.Study on the effects of monascus culture conditions on the esterifying capacity of fatty acid ester[J].Liquor-Making Science ﹠ Technology，2009，（1）：17-20.（in Chinese）

[8]趙樹欣，湯衛(wèi)華，喬長(zhǎng)晟.添加酵母破壁液提高紅曲霉Monacolin K產(chǎn)率[J].食品科學(xué)，2004（25）：119-121.ZHAO Shu-xin，TANG Wei-hua，QIAO Chang-sheng.Enhanced monacolin K production of Monascus rubber by adding yeast lysate[J].Food Science，2004（25）：119-121.（in Chinese）

[9]Shin C S，Kim M J，Ju J Y.Morphological change and enhanced pigment production of monascus when concultured with Saccharomyces cerevisiae or Aspergillus oryzae[J].Biotechnol Bioeng，1998，59：576-581.

[10]Shimada Y，Sugihara A，Nagao T et al.Induction of Geotrichum candidum lipase by long-chain fatty acids[J].Joumal of fermentation and bioengineering，1992，74（2）：77-80.

[11]潘運(yùn)國(guó)，陳義倫，張策，等.霉菌液態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)酯化酶規(guī)律研究[J].釀酒科技，2005，11：35-37.PAN Yun-guo，CHEN Yi-lun，ZHANG Ce，et al.Study on the production rules of esterified enzyme by mould liquid culture[J].Liquor-Making Science ﹠ Technology，2005，11：35-37.（in Chinese）

[12]劉志鈺，張東旭，堵國(guó)成，等.Paecilomyces sp.S152 胞外漆酶的合成調(diào)控[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，29（6）：952-957.LIU Zhi-Yu，ZHANG Dong-Xu，DU Guo-cheng，et al.Improvement of extracellular laccase production by Paecilomyces sp.S152[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2010，29（6）：952-957.（in Chinese）

[13]Hama S，Yamaji H，Kaieda M，et a1.Effect of fatty acid membrane composition on whole-cell biocatalysts for biodiesel-fuel production[J].Biochemical Engineering Journal，2004，（21）：155-160.

[14]唐玉明，劉宇馳，卓毓崇.紅曲酯化菌21-3選育及特性研究[J].釀酒科技，2005（8）：32-34.TANG Yu-ming，LIU Yu-chi，ZHUO Yu-chong.Reseach on the properties and breeding of Monascus Esterifying Strain 21-3（Monascus Pilosus）[J].Liquor-Making Science ﹠ Technology，2005（8）：32-34.（in Chinese）