應(yīng)用新型復(fù)合保護(hù)劑制備高活性直投式干酪乳桿菌發(fā)酵劑

張 娟 ， 劉 茜 ， 吳重德 ， 堵國(guó)成 ， 陳 堅(jiān)

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；4.四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，四川 成都610065）

由于乳酸菌本身對(duì)外界環(huán)境的耐受能力較差，在生產(chǎn)加工及儲(chǔ)藏運(yùn)輸環(huán)節(jié)所面臨的不利條件往往導(dǎo)致乳酸菌活性的迅速下降，從而嚴(yán)重影響了乳酸菌的功能。為保證乳酸菌發(fā)酵劑的活性，提高乳酸菌制劑的應(yīng)用效能，目前國(guó)內(nèi)外在乳酸菌的制劑化研究中通常采用直投式冷凍干燥的制備方法，并以真空冷凍干燥法的制備效果最為理想[1-3]。然而，在應(yīng)用真空冷凍干燥法進(jìn)行乳酸菌制劑化處理的同時(shí)，該處理過程中的低溫、脫水等加工條件將對(duì)乳酸菌的活性產(chǎn)生難以避免的損傷。因此，選擇理想的冷凍干燥保護(hù)劑維持該處理過程中細(xì)胞的活性成為應(yīng)用真空冷凍干燥法進(jìn)行制劑化研究中備受關(guān)注的熱點(diǎn)問題。

目前，對(duì)冷凍干燥保護(hù)劑的研究與應(yīng)用主要分為以下幾類：①糖/多元醇類：如單糖（葡萄糖、果糖等）、低聚糖（蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖等）、多元醇（甘露醇、甘油、山梨醇）等；②聚合物類：如膠類（阿拉伯膠、卡拉膠、動(dòng)物膠等）、可溶性淀粉等；③蛋白類：如脫脂乳、血清蛋白等；④表面活性劑、氨基酸類：如L-脯氨酸、谷氨酸鈉等[4]。此外，細(xì)胞在冷凍干燥處理過程中的生理狀態(tài)也受到研究人員的日益關(guān)注。雖然目前尚無直接方法證明冷凍干燥對(duì)乳酸菌胞內(nèi)環(huán)境的影響，然而已有關(guān)于過氧化氫酶、脂酶、乳酸脫氫酶等對(duì)冷凍干燥處理過程較為敏感的相關(guān)報(bào)道[5]，從而為揭示該過程中細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化提供了有力證據(jù)。

谷胱甘肽（glutathione）是由 L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)過肽鍵縮合形成的三肽化合物。還原型谷胱甘肽（GSH）對(duì)維持細(xì)胞正常的氧化還原狀態(tài)具有重要作用，能夠清除體內(nèi)自由基，保護(hù)DNA、蛋白質(zhì)和其它生物分子抵抗氧化環(huán)境的侵害。

基于上述情況，作者以具有優(yōu)良益生功能的乳酸菌菌株Lactobacillus casei Zhang為研究對(duì)象，結(jié)合冷凍干燥發(fā)酵劑制備過程中細(xì)胞自身的生理特征，通過新型復(fù)合冷凍干燥保護(hù)劑的研究提高乳酸菌直投式發(fā)酵劑的生理活性及其應(yīng)用性能。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 試劑 葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甘油、抗壞血酸、氯化鈉、無水氯化鈣、海藻酸鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉：國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭畸溠刻?、海藻糖、山梨醇、谷氨酸鈉：國(guó)產(chǎn)化學(xué)純?cè)噭?；均?gòu)自中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司。

脫脂奶粉：購(gòu)自伊利公司；谷胱甘肽：購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

真空冷凍干燥機(jī) （4K XL）：Virtis公司產(chǎn)品；冷凍立式離心機(jī)（CF16RX）：日本Hitachi公司產(chǎn)品；小型高速離心機(jī)（5418）：Eppendorf公司產(chǎn)品；臨界點(diǎn)干燥儀（CPD-030）：BAL-TEC公司產(chǎn)品；離子濺射儀（SCD-005）：BAL-TEC 公司產(chǎn)品；掃描電子顯微鏡（QUANTA-200）：FEI公司產(chǎn)品。

1.2 菌株

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Zhang，以下簡(jiǎn)稱L.casei Zhang），由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

1.3.1 培養(yǎng)基 Lactobacilli MRS肉湯培養(yǎng)基：購(gòu)自O(shè)xoid公司。每升培養(yǎng)基所含成分為：蛋白胨10.0 g，葡萄糖20.0 g，酵母提取物4.0 g，肉汁粉8.0 g，山梨糖醇酐單油酸酯1 mL，七水硫酸鎂0.2 g，四水硫酸錳0.05 g，三水醋酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸銨2.0 g，pH值 6.2±0.2。生長(zhǎng)培養(yǎng)基為MRS肉湯液體培養(yǎng)基；計(jì)數(shù)培養(yǎng)基為MRS肉湯培養(yǎng)基加入1.2%瓊脂粉。

1.3.2 培養(yǎng)條件 取保藏于-70℃冰箱的L.casei Zhang液體甘油管，以無菌操作方式按體積分?jǐn)?shù)5%接種量接種于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)20 h。

1.4 菌體細(xì)胞的冷凍干燥法制備

離心收集活化培養(yǎng)后的菌體細(xì)胞（10 000 g，10 min），經(jīng)生理鹽水洗滌兩次并離心濃縮5倍后，加入保護(hù)劑溶液（菌懸液、保護(hù)劑體積比為1∶3）。計(jì)算初始活菌數(shù)（cfu/mL）后分裝進(jìn)行冰箱預(yù)凍（-70℃，12 h）。 經(jīng)冷凍干燥機(jī)凍干后 （-60℃，6.67 Pa，30 h），進(jìn)行復(fù)水處理并計(jì)算活菌數(shù)（cfu/mL）。

1.5 冷凍干燥保護(hù)劑的制備

1.5.1 單一冷凍干燥保護(hù)劑的制備 選取葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、甘油、脫脂奶粉、抗壞血酸和谷胱甘肽作為保護(hù)劑，與離心后的菌泥混合，預(yù)凍后進(jìn)行冷凍干燥處理。冷凍干燥保護(hù)劑的選取如表1所示。

表1 不同單一冷凍干燥保護(hù)劑的制備Tab.1 Preparation of different mono-cryoprotectants

1.5.2 復(fù)合冷凍干燥保護(hù)劑的篩選 選擇單因素優(yōu)化后的冷凍干燥保護(hù)劑及其相應(yīng)濃度，應(yīng)用7因素二次旋轉(zhuǎn)正交組合設(shè)計(jì)完善L.casei Zhang保護(hù)劑保護(hù)模型，實(shí)驗(yàn)方案如表2所示。

表2 復(fù)合冷凍干燥保護(hù)劑的篩選Tab.2 Design of multiple cryoprotectants for L.casei Zhang

1.6 存活率的測(cè)定

冷凍干燥處理后的菌體干粉加入凍干處理前等體積的生理鹽水（0.85 g/dL NaCl）復(fù)水后，取10 μL重懸液，以不同的稀釋度點(diǎn)種于MRS培養(yǎng)基平板上測(cè)定單位體積菌落數(shù) （colony forming unit per unit，cfu/mL）。將平板放置在 37℃下培養(yǎng) 36 h，對(duì)平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本設(shè)3個(gè)平行樣。應(yīng)用Excel軟件計(jì)算存活率平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。計(jì)算存活率時(shí)，考慮了誤差的傳遞。

V1為冷凍干燥處理前的活菌數(shù)（l mL液體樣的活菌數(shù)，cfu/mL）；V2為冷凍干燥處理后的活菌數(shù)（l mL液體樣凍干后的活菌數(shù)，cfu/mL）。

誤差傳遞公式：

A為凍干后的菌落數(shù)（cfu/mL）；△A為凍干后的誤差（cfu/mL）；B 為對(duì)照的菌落數(shù)（cfu/mL）；△B 為對(duì)照的誤差（cfu/mL）；C 為存活率（%）；△C 為存活率誤差（%）]。

1.7 細(xì)胞膜脂肪酸成分的測(cè)定

細(xì)胞膜脂肪酸樣品的制備按照Sasser的方法進(jìn)行[6]。

氣相色譜分析條件：PEG毛細(xì)管填充柱（30 m×0.22 mm，0.25 μm，Restek）；載氣：氦氣；流量：29.6 mL/min；柱壓：63.4 kPa；柱流量：0.5 mL/min；進(jìn)樣口溫度：260 °C；檢測(cè)器溫度：280 °C；柱溫升溫程序：起始溫度為100°C，保持1 min，隨后以4°C mL/min的速率增至250°C并在250°C保持5 min。每個(gè)樣本設(shè)定3個(gè)平行樣。

1.8 掃描電鏡樣品的制備

將經(jīng)過包埋處理的樣品于4℃下用體積分?jǐn)?shù)3%戊二醛固定，固定后用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗數(shù)次，再次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%四氧化鋨固定，用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗數(shù)次后，經(jīng)乙醇體積分?jǐn)?shù)梯度脫水（30%、50%、70%），在醋酸異戊酯過渡后放入臨界點(diǎn)干燥儀 （CPD-030），干燥后經(jīng)離子濺射（SCD-005），最終通過QUANTA-200掃描電鏡觀察并拍攝電鏡照片。

2 結(jié)果

2.1 使用不同單一保護(hù)劑對(duì)提高乳酸菌冷凍干燥存活率的比較

冷凍干燥成功的關(guān)鍵在于有效保護(hù)劑的使用，凍干保護(hù)劑不僅影響乳酸菌在凍干過程中的細(xì)胞存活率，還將影響保藏期間的細(xì)胞穩(wěn)定性[7]。為考察最佳的單一冷凍干燥保護(hù)劑，通過前期的預(yù)備實(shí)驗(yàn)確定了L.casei Zhang的最佳收獲時(shí)間為穩(wěn)定前期，結(jié)合相關(guān)資料選取葡萄糖、麥芽糖、海藻糖、山梨醇、脫脂奶粉，抗壞血酸、谷胱甘肽考察了單一保護(hù)劑對(duì)L.casei Zhang冷凍干燥處理過程的保護(hù)作用，研究結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，脫脂奶粉作為單一保護(hù)劑時(shí)菌體細(xì)胞經(jīng)冷凍干燥處理后的存活率最高，約為以生理鹽水為對(duì)照時(shí)的5.56倍。作為大分子類保護(hù)劑的代表，脫脂奶粉的作用主要通過乳清蛋白在菌體外形成蛋白膜，對(duì)細(xì)胞加以保護(hù)，并可以固定凍干的酶類，防止由于細(xì)胞壁蛋白質(zhì)損傷而引起的胞內(nèi)物質(zhì)滲漏；同時(shí)，乳中其它成分（如乳糖等）也可提高菌體細(xì)胞的凍干存活率[8]。

圖1 L.casei Zhang單一保護(hù)劑效果Fig.1 Survival of freeze-dried L.casei Zhang

作為傳統(tǒng)的冷凍干燥保護(hù)劑，糖類與多元醇類的保護(hù)作用如圖1所示。添加糖類作為保護(hù)劑后，菌體存活率與對(duì)照樣本相比均有一定程度的上升，其中以海藻糖的保護(hù)作用最為顯著，與對(duì)照相比，L.casei Zhang細(xì)胞的存活率提高了3.42倍。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析可知，糖類保護(hù)劑的作用效果由強(qiáng)到弱依次為海藻糖、麥芽糖和葡萄糖，這恰好與它們玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度由高到低的順序一致[9]，而玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度能夠有效地防止水對(duì)玻璃態(tài)的增塑作用[10]，從而進(jìn)一步削弱冷凍干燥過程中由于處理工藝條件造成的細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷。

與糖類似，多元醇的官能團(tuán)也是羥基，因此可以在冷凍干燥過程中發(fā)揮保護(hù)作用，取代水分子與菌體細(xì)胞膜磷脂中的磷酸基團(tuán)或與菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵，保護(hù)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性。在前期的預(yù)備實(shí)驗(yàn)中，考察了山梨醇、甘露醇和甘油對(duì)細(xì)胞存活率的影響，其中山梨醇的保護(hù)效果相對(duì)于另兩種保護(hù)劑較好（數(shù)據(jù)未給出），因此，選擇適當(dāng)濃度的山梨醇與其他類型的保護(hù)劑進(jìn)行了比較。由圖1可知，山梨醇在保護(hù)L.casei Zhang時(shí)相對(duì)空白樣本的存活率提高了2.02倍，其作用效果可能與其在慢速結(jié)晶過程中形成結(jié)晶，從而為細(xì)胞內(nèi)的活性組分提供支撐結(jié)構(gòu)有關(guān)[11]。

值得關(guān)注的是，抗氧化劑GSH在冷凍干燥過程中也表現(xiàn)出較為顯著的保護(hù)作用。經(jīng)GSH保護(hù)下的L.casei Zhang細(xì)胞存活率與對(duì)照樣本相比提高了5.42倍，顯著高于傳統(tǒng)的糖/醇類冷凍干燥保護(hù)劑。

2.2 不同保護(hù)劑復(fù)配對(duì)提高乳酸菌冷凍干燥存活率的比較

菌體細(xì)胞在凍干過程中受到的損傷是多方面的，而各種類型的凍干保護(hù)劑的保護(hù)作用機(jī)制也存在差異，為獲得更優(yōu)化的冷凍干燥保護(hù)效果，進(jìn)一步開展了不同保護(hù)劑的混合添加研究?；趩我粌龈杀Ｗo(hù)劑篩選的研究結(jié)果，以脫脂乳作為凍干保護(hù)劑基礎(chǔ)介質(zhì)，與之協(xié)同作用的保護(hù)劑種類及相關(guān)保護(hù)效果如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)使用以20 g/dL脫脂奶粉為基質(zhì)的復(fù)合保護(hù)劑時(shí)，經(jīng)凍干處理的細(xì)胞活力與單一保護(hù)劑相比均呈現(xiàn)增加態(tài)勢(shì)。在上述冷凍干燥保護(hù)劑中，GSH的保護(hù)效果最為顯著。保護(hù)劑按照保護(hù)作用的方式分為滲透型和非滲透型[12]。滲透型以低分子化合物為代表，在冷凍干燥過程中能夠進(jìn)入細(xì)胞，結(jié)合水分子發(fā)生水合反應(yīng)，使溶液的粘度增加，從而減緩冰晶形成速度，降低系統(tǒng)因水轉(zhuǎn)化為冰所造成的細(xì)胞損傷；高分子化合物則能夠在凍干過程中降低溶液結(jié)冰的速度，降低細(xì)胞外的溶質(zhì)濃度，避免由于鹽類濃縮而引起的細(xì)胞脫水，從而減少細(xì)胞發(fā)生滲透壓性休克、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜塌陷、蛋白質(zhì)變性等不良后果[13]。在本研究中，通過冷凍干燥過程中低分子保護(hù)劑與高分子保護(hù)劑的結(jié)合，顯示出較好的保護(hù)作用效果。

圖2 以脫脂乳為基質(zhì)的混合保護(hù)劑作用效果Fig.2 Survivaloffreeze-driedL.caseiZhang

2.3 優(yōu)化復(fù)合保護(hù)劑提高乳酸菌冷凍干燥存活率

在上述研究的基礎(chǔ)上，為獲得理想的冷凍干燥保護(hù)效果，對(duì)不同類型的冷凍干燥保護(hù)劑進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)分析。分別選取蔗糖、麥芽糖、海藻糖、山梨醇、脫脂奶粉、抗壞血酸及谷胱甘肽進(jìn)行復(fù)合保護(hù)劑的優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析見表3。

表3 L.casei Zhang正交設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)及結(jié)果aTab.3 Orthogonal experiment of L.casei Zhanga

表3顯示，在L.casei Zhang進(jìn)行正交復(fù)配保護(hù)劑實(shí)驗(yàn)時(shí)（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），蔗糖10%、麥芽糖10%、海藻糖5%、山梨醇5%、脫脂奶粉20%、抗壞血酸2%、谷胱甘肽0.5%為最佳保護(hù)劑組合，細(xì)胞存活率可達(dá)54.5%。

2.4 新型冷凍干燥保護(hù)劑谷胱甘肽對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響

細(xì)胞膜作為細(xì)胞抵抗惡劣環(huán)境的第一道屏障，伴隨著環(huán)境的變化，細(xì)胞膜組成結(jié)構(gòu)往往發(fā)生一定范圍的變化。尤其是細(xì)胞膜脂肪酸成分的變化將直接導(dǎo)致細(xì)胞的流動(dòng)性變化，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重影響，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。隨著對(duì)乳酸菌發(fā)酵劑研究的不斷深入，冷凍干燥過程中細(xì)胞微環(huán)境的變化也受到越來越多的關(guān)注。

通過考察細(xì)胞膜脂肪酸的變化，如不飽和脂肪酸含量變化和細(xì)胞膜脂肪酸鏈長(zhǎng)變化，能夠反應(yīng)細(xì)胞在冷凍干燥過程中流動(dòng)性的變化過程，從而為揭示冷凍干燥過程中保護(hù)劑的作用機(jī)制提供可借鑒的思路。如表 4 所示，肉豆蔻酸（C14∶0）、十五烷酸（C15∶0）、棕 櫚 酸 （C16∶0）、 十 七 烷 酸 （C17∶0）、硬 脂 酸（C18∶0）、油酸 （C18∶1-9）、 十八碳烯酸（C18∶1-11）、亞油酸（C18∶2）和 環(huán) 丙烷 脂 肪 酸 （C19∶0-9）分 別 是 L.casei Zhang細(xì)胞膜脂肪酸的主要組成部分。在冷凍干燥過程中細(xì)胞膜脂肪酸成分發(fā)生了明顯變化。未添加谷胱甘肽作為保護(hù)劑時(shí)，飽和脂肪酸（C14∶0，C15∶0，C16∶0，C17∶0，C18∶0）占 所 有 脂 肪 酸 的 比 例 從 45.1%上 升 到72.2%， 同時(shí)不飽和脂肪酸 （C18∶1w7，C18∶1w9，C18∶2and C19∶0-9）占所有脂肪酸的比例有明顯下降，從54.9%降至27.8%。細(xì)胞膜脂肪酸飽和度的變化可能直接影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性[14]，進(jìn)而能夠反映出細(xì)胞在抵抗環(huán)境壓力時(shí)的變化[15]。上述脂肪酸成分的變化表明，在冷凍干燥過程中，細(xì)胞膜脂肪酸中含有雙鍵的不飽和脂肪酸大多被氧化，這將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性發(fā)生顯著變化，進(jìn)而造成細(xì)胞在該過程中的死亡[16]。

有趣的是，在添加谷胱甘肽作為冷凍干燥保護(hù)劑后，細(xì)胞膜脂肪酸不飽和度（即U/S值）為0.79，是對(duì)照樣本的2.02倍。與對(duì)照樣本相比，這一明顯上升的細(xì)胞膜脂肪酸不飽和度反映了在冷凍干燥過程中，谷胱甘肽能夠有效地維持冷凍干燥過程中細(xì)胞膜的氧化還原平衡狀態(tài)，進(jìn)而保持細(xì)胞膜的流動(dòng)性，減少細(xì)胞因冷凍干燥處理造成的活性下降甚至死亡[17-18]。

表4 冷凍干燥前后細(xì)胞膜脂肪酸組成與鏈長(zhǎng)的變化aTab.4 Composition and chain length of membrane fatty acids during freeze-drying treatmenta

對(duì)不同類型的脂肪酸而言，脂肪酸中雙鍵和環(huán)狀結(jié)構(gòu)的增加能較好地提高細(xì)胞膜的不飽和度[19]。在添加谷胱甘肽的情況下，檢測(cè)到具有提高細(xì)胞膜彈性和流動(dòng)性的環(huán)丙烷脂肪酸 （ΔC19：0-9）的出現(xiàn)[20]，而未添加谷胱甘肽的樣本則未在脂肪酸組分中檢測(cè)到環(huán)丙烷脂肪酸。此外，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽作為冷凍干燥保護(hù)劑在保護(hù)細(xì)胞的同時(shí)減少了飽和脂肪酸的鏈長(zhǎng)，這一變化有利于維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性。如表4所式，對(duì)照樣本的飽和脂肪酸鏈長(zhǎng)在經(jīng)過冷凍干燥后為17.1，而谷胱甘肽參與下，其值下降到16.0。因此推測(cè)，谷胱甘肽在乳酸菌細(xì)胞冷凍干燥過程中的保護(hù)原理與其抵抗冷凍干燥處理誘發(fā)的細(xì)胞膜脂肪酸氧化，維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性具有密切的關(guān)系。

2.5 新型冷凍干燥保護(hù)劑谷胱甘肽對(duì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性是影響細(xì)胞活性的另一重要因素[21-23]。菌體細(xì)胞在冷凍干燥過程中往往會(huì)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)塌陷等情況[21]。將未添加冷凍干燥保護(hù)劑與添加谷胱甘肽作為冷凍干燥保護(hù)劑的細(xì)胞凍干粉通過掃描電鏡進(jìn)行觀察。如圖3所示，在谷胱甘肽存在的情況下細(xì)胞形態(tài)較完整，并沒有出現(xiàn)因細(xì)胞膜破裂而導(dǎo)致的胞內(nèi)物質(zhì)外溢（圖 3（a），（c））；而未添加保護(hù)劑的細(xì)胞在經(jīng)過冷凍干燥處理后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞表面粗糙甚至細(xì)胞破裂的情況（圖3（b），（d））。

3 結(jié)語(yǔ)

在應(yīng)用高效冷凍干燥保護(hù)劑制備直投式乳酸菌的研究中，采用單一型、復(fù)合型與正交復(fù)配保護(hù)劑對(duì)冷凍干燥保護(hù)劑的優(yōu)化策略進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，以傳統(tǒng)冷凍干燥保護(hù)劑為基礎(chǔ)組分，通過添加新型凍干保護(hù)劑谷胱甘肽能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞經(jīng)冷凍干燥處理的存活率。進(jìn)一步分析表明，谷胱甘肽通過增加冷凍干燥過程中細(xì)胞膜脂肪酸的不飽和度以及縮短膜脂肪酸鏈長(zhǎng)等方式增強(qiáng)了細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而有效地維持了冷凍干燥過程中細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。上述研究結(jié)果對(duì)基于微生物細(xì)胞在冷凍干燥過程中的生理狀態(tài)變化，開拓新型高效的凍干保護(hù)劑提供了可借鑒的思路。

圖3 冷凍干燥后細(xì)胞形態(tài)Fig.3 Morphological changes of L.casei Zhang during freeze drying

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