福建絞股藍皂苷的優(yōu)化提取及其抗肝癌活性

陳良華， 鄭志忠， 張樹峰，3， 諶迪， 明艷林， 陳清西， 童慶宣 *

（1.廈門華僑亞熱帶植物引種園/廈門市引種檢疫與植物源產物重點實驗室，福建 廈門 361002；2.廈門大學 生命科學學院，福建 廈門361005；3.華僑大學 化工學院，福建 廈門 361021）

絞 股 藍 （Gynostemma pentaphyllum Thnmb Mak.）為葫蘆科絞股藍屬植物，俗稱七葉膽、小苦藥、遍地生根、甘茶蔓等，其種類繁多，有14個種2個變種，2001年國家林業(yè)局保護司關于征集 《國家重點保護野生植物名錄》（第二批）文件中，把絞股藍調整為國家重點保護藥食同源性植物[1]。

絞股藍的化學成分研究始于20世紀70年代，主要藥效成分為絞股藍皂苷（Gypenoside），目前有報道稱從絞股藍中分離出的絞股藍皂苷已達到169種之多[2]。由于絞股藍種類多，甚至同種絞股藍又可因種植產地、采收季節(jié)及光照條件等諸多環(huán)境因素影響，其中含有的絞股藍皂苷數量和組成成分比例上有較大差異，對絞股藍的研究如化學成分分來說品種選擇顯得尤為重要。絞股藍皂苷結構上與人參皂苷具有類似主骨架的達瑪烷型結構，屬于四環(huán)三萜皂苷，其中GPYⅢ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ分別與人參皂苷Rbl、Rbl、Rd、F2 化學結構上完全相同， 因此絞股藍皂苷許多藥理作用與人參皂苷相似，其中主要有抗腫瘤[3]、降血脂血糖[4]、保護心臟和肝臟[5]和防止衰老[6]等藥理作用。目前在抗腫瘤研究方面，較多也僅限于對絞股藍總皂苷對腫瘤細胞抑制作用和機理研究[7-8]，單體絞股藍皂苷抗腫瘤作用研究還相對較少，僅見少許報道[9-10]。

絞股藍在福建省有豐富資源，福建亞熱帶植物研究所曾對福建省絞股藍資源進行實地調查，全省野生絞股藍不僅分布范圍廣、地點多，而且生態(tài)類型多樣。以絞股藍口感品味劃分有三大類型；甘甜型、腥苦型和清淡型。三大類型間還有過渡類型。各類型均有生長，其中腥苦型較多，甘甜型和清淡型較少[11]。絞股藍資源的多樣類型為篩選適于提取精品，直接沖泡等不同用法提供豐富的原始材料和廣泛的種源。作者選用福建南靖絞股藍為材料，通過HPLC分析絞股藍成分，并探討絞股藍皂苷的提取及其抗癌活性研究，為后續(xù)絞股藍抗癌成分分離純化和藥物的研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

“201”七葉甜甘型絞股藍：采自福建南靖種植區(qū)；肝癌細胞SMCC7721和Bel7402：購自中科院上海生化與細胞所；人參皂苷Rb1：購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 實驗儀器和試劑

液相色譜儀：Agilent 1200，Agilent公司產品；酶標儀：MK3，美國Thermo公司產品；新生牛血清：購自HyClone公司；RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基：購自GIBCO公司；青霉素鈉、鏈霉素鈉：購自上海Sangon公司；乙腈：購自 Merck 公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 （MTT）：購自 Sigma公司；其它化學試劑均為國產分析純試劑。

1.3 方法

1.3.1 絞股藍皂苷的提取 采集的新鮮絞股藍曬干并剪成3～5 cm小段，用高速粉碎機磨成粉末狀。稱取4份50 g絞股藍粉末于三角瓶中，分別加入20倍量約1 L體積的水，體積分數45%，75%和95%乙醇溶劑分3次提??；每次在60℃水浴鍋中加熱浸提12 h后，真空抽濾獲得絞股藍提取液，合并提取液經旋轉蒸發(fā)儀濃縮去除乙醇溶劑，獲得絞股藍乙醇提取物。

1.3.2 不同極性絞股藍皂苷的提取和正交優(yōu)化

稱取4份10 g絞股藍粉末，分別加入水，體積分數15%，30%，45%的乙醇溶液為溶劑提取絞股藍皂苷，通過HPLC分析確定極性絞股藍皂苷的乙醇濃度；另稱取4份10 g絞股藍粉末經極性絞股藍皂苷提取后，再選用體積分數70%，80%，90%，100%乙醇溶液提取，通過HPLC分析確定弱極性絞股藍皂苷的乙醇體積分數；最后選取溶劑用量、提取溫度和提取時間作為考察因素，每個因素設3個水平，采用L9（33）正交實驗優(yōu)化極性和弱極性絞股藍皂苷的提取。

1.3.3 絞股藍皂苷HPLC分析 色譜條件：色譜柱為 Agilent Eclipse XDB-C18 （150 mm×4.6 mm）；柱溫：25 ℃；檢測波長：203 nm；流量：1.0 mL/min；進樣量為 20 μL，流動相為：水（A）/乙腈（B）梯度洗脫，流動相體積比的梯度洗脫條件為0～8 min：A，80%，B，20% ；8 ～20 min：A，65% ，B，35% ；20 ～35 min：A，30% ，B，70% ；35 ～40 min：A，30% ，B，70% ；40 ～50 min：B，100%；50～60 min：B，100% ；60～70 min：A，80%，B，20%。

1.3.4 絞股藍皂苷質量分數測定 按照文獻[12]的方法，并作適當調整。配置質量濃度為2 mg/mL的人參皂苷Rb1為對照品，以吸光值為縱坐標，樣品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。絞股藍皂苷含量測定為：取200 μL樣品液于具塞試管中，加入800 μL質量分數為5%香草醛-高氯酸溶液，60℃水浴加熱15 min，取出后冷卻至室溫，用冰醋酸定容成終體積3 mL，在紫外分光光度計550 nm下測定吸光值，根據標準曲線計算絞股藍皂苷含量。

1.3.5 MTT法測定絞股藍皂苷抗癌活性 利用MTT 法 測 定 不 同 質 量 濃 度 （0、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL）絞股藍總皂苷（GYP）、極性絞股藍皂苷（GYP1）和弱極性絞股藍皂苷（GYP2）作用 72 h后，分別對肝癌細胞SMCC77221和Bel7402的體外抑制作用。具體方法如下：取對數生長期細胞，質量分數為0.25%胰酶消化，用細胞培養(yǎng)液制成細胞數為5×104個/mL的單細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后，吸去細胞培養(yǎng)液，分別加入100 μL的對照組培養(yǎng)液和含絞股藍皂苷的實驗組培養(yǎng)液，每組4個重復，共培養(yǎng)72 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入 MTT （0.5 mg/mL）200 μL，再培養(yǎng) 4 h，吸去上清液，加入 DMSO 200 μL 振蕩 10 min，在酶標儀上讀取570 nm處吸光度（A570nm值）。細胞抑制率=（A對照組－A給藥組）/A對照組×100%。

2 結果與討論

2.1 絞股藍皂苷HPLC分析

絞股藍中含有達瑪烷型為主骨架的多種絞股藍皂苷，側鏈銜接的基團不同導致絞股藍皂苷極性的差異。作者以福建南靖絞股藍為材料，為分析絞股藍含有皂苷的種類和數量，通過HPLC分析不同乙醇體積分數對絞股藍皂苷提取的影響，結果表明：不同體積分數乙醇對提取絞股藍皂苷有很大的影響，乙醇體積分數越高提取的絞股藍皂苷數量越多，而比較絞股藍HPLC圖譜洗脫峰可知南靖絞股藍含有20～30 min和45～60 min保留時間的2個組份極性差異的絞股藍皂苷（圖1a），可以選定不同的乙醇體積分數分別提取該2組份的絞股藍皂苷以便后續(xù)的分離純化研究。將體積分數75%乙醇提取總成分定為絞股藍總皂苷（GYP），保留時間為20～30 min組份皂苷定為極性絞股藍皂苷（GYP1），保留時間為45～60 min組份皂苷定為弱極性絞股藍皂苷（GYP2）。

為選定乙醇體積分數分別提取GYP1和GYP2，分別選取水，體積分數15%，30%，45%乙醇溶液提取絞股藍，進而再用體積分數70%，80%，90%，100%乙醇溶液提取，通過HPLC分析表明：體積分數45%乙醇能有效提取GYP1該部分的極性絞股藍皂苷（圖1b），體積分數90%乙醇能有效提取GYP2該部分的弱極性絞股藍皂苷（圖1c）。

圖1 絞股藍皂苷HPLC分析Fig.1 HPLC analysis of gypenoside

2.2 正交優(yōu)化提取極性絞股藍皂苷

根據上述確定體積分數為45%乙醇溶液適宜于提取GYP1，采用加熱浸提法，選定溶劑用量、提取溫度和提取時間3個因素，以提取液中皂苷含量為考察指標，設定正交實驗考察3個因素對GYP1提取的影響，正交實驗結果見表1。由極差R可知，各因素對提取GYP1的影響程度的依次順序為A（溶劑用量）>B（提取溫度）>C（提取時間），即溶劑用量對GYP1的提取影響最大，其次是提取溫度，而提取時間影響最小，同時確定提取優(yōu)化的最佳條件為A3B3C3，即在70℃水浴中，以30倍質量的體積分數45%乙醇溶液加熱提取12 h，根據優(yōu)化的條件進行驗證實驗，3組并行實驗測定的皂苷得率為3.12%，3.26%和3.32%，平均值得率為3.23%。

表1 正交實驗結果與分析（GYP1）Tab.1 Design and result of orthogonal test

2.3 正交優(yōu)化提取弱極性絞股藍皂苷

根據上述確定體積分數為90%乙醇溶液適宜于提取GYP2，采用加熱浸提法，選定溶劑用量、提取溫度和提取時間3個因素，以提取液中皂苷含量為考察指標，設定正交實驗考察3個因素對GYP2提取的影響，正交實驗結果見表2。由極差R可知，各因素對提取GYP2的影響程度的依次順序為A（溶劑用量）>B（提取溫度）>C（提取時間），即溶劑用量對GYP2的提取影響最大，其次是提取溫度，而提取時間影響最小，同時確定優(yōu)化提取的最佳條件為A3B3C2，即在60℃水浴中，以30倍量的體積分數90%乙醇溶液加熱提取6 h，在正交實驗9個組合中，該組合的提取得率為3.21%均高于其他組，證明正交優(yōu)化結果的可靠性。

表2 正交實驗結果與分析（GYP2）Tab.2 Design and result of orthogonal test

2.4 絞股藍皂苷抗肝癌活性

利用MTT法測定絞股藍總皂苷（GYP）、極性絞股藍皂苷（GYP1）和弱極性絞股藍皂苷（GYP2）分別對肝癌細胞 SMCC77221（圖 2a）和 Bel7402（圖 2b）的體外抑制作用。從圖2抑制曲線可知：皂苷對肝癌細胞作用 72 h后，GYP和 GYP2對肝癌細胞SMCC7721有抑制作用，半抑制率IC50值分別為（165.83±14.12）μg/mL 和 （113.97±9.26）μg/mL，而GYP1在 0～200 μg/mL 濃 度范 圍內 對 肝 癌 細 胞SMCC抑制沒有達到50%半抑制率，表明基本沒有抑制作用，該結果表明GYP的對肝癌細胞的抗癌活性可能主要由GYP2起作用的，絞股藍抗癌活性物質主要是由弱極性皂苷發(fā)揮功效；GYP、GYP1和GYP2在0～200 μg/mL質量濃度范圍內對肝癌細胞Bel7402也基本沒有抑制作用，都沒有達到50%半抑制率。上述結果表明，絞股藍皂苷對肝癌細胞SMCC的作用較為敏感，而對肝癌細胞Bel7402作用不敏感。

圖2 絞股藍皂苷對肝癌細胞體外抑制作用Fig.2 Inhibition effect of gypenoside on the growth of Hepatocellular carcinoma cells in vitro

3 結語

為優(yōu)選提取工藝，最大限度地提取有效成分，提高目標成分的純度，減少非目標成分的溶出，為后期的分離純化創(chuàng)造更好地條件，分別研究不同體積分數乙醇提取福建南靖絞股藍中極性皂苷和弱極性皂苷，并通過正交實驗優(yōu)化提取過程。確定體積分數為45%乙醇溶液提取極性絞股藍皂苷，體積分數為90%乙醇溶液提取弱極性絞股藍皂苷；正交實驗優(yōu)化提取在70℃水浴中以30倍質量的體積分數45%乙醇溶液加熱提取12 h為最佳提取極性絞股藍皂苷，在60℃水浴中以30倍量的體積分數90%乙醇溶液加熱提取6 h為最佳提取弱極性絞股藍皂苷。

皂苷的藥效作用與側鏈糖基有直接關系，結構中糖基側鏈的不同，而顯示出不同性質和藥理活性。目前利用生物轉化手段將高糖鏈的皂苷結構修飾成低糖鏈活性更高的皂苷或苷元，已成為皂苷研究的熱點，而應用中藥生物轉化技術可以為開發(fā)新藥、提高藥物療效、降低藥物毒副作用的研究提供新的手段[13]。比較測定了提取的極性絞股藍皂苷和弱極性絞股藍皂苷的抗肝癌活性，結果表明絞股藍抗癌藥效主要是由弱極性皂苷起主要作用，極性皂苷基本沒有抗癌作用。優(yōu)化提取的弱極性皂苷抗癌作用將為后期分離純化絞股藍抗癌活性物質奠定基礎。

[1]Valentina R N，Tom H H，Van H T，et al.Chemistry and pharmacology of Gynostemma pentaphyllum[J].Phytochemistry Review，2005，4：197-219.

[2]Ji H K，Yong N H.Dammarane-type saponins from Gynostemma pentaphyllum[J].Phytochemistry，2011，72：1453-1459.

[3]Lu Kung-wen，Tsai M L，Chen Jung-chou，et al.Gypenosides inhibited invasion and migration of human tongue cancer SCC4 cells through down-regulation of NF-kappaB and matrix metalloproteinase-9[J].Anticancer Research，2008，28（2）：1093-1099.

[4]Yeo J，Kang Y J，Jeon S M，et al.Potential hypoglycemic effect of an ethanol extract of Gynostemma pentaphyllum in C57BL/KsJ-db/db mice[J].Journal of Medicinal Food，2008，11：709-716.

[5]陳幾香，張建國，張莉，等.絞股藍總皂苷保肝作用實驗研究[J].中國藥業(yè)，2007，13：7-8.CHEN Ji-xiang，ZHANG Jian-guo，ZHANG Li，et al.Study on liver protective effect of total saponins of Gynostemma pentaphyllum[J].China Pharmaceuticals，2007，13：7-8.（in Chinese）

[6]劉國輝，姚丹丹，盧佳怡，等.絞股藍對D-半乳糖所致亞急性衰老大鼠下丘腦的抗衰老作用及其機制研究[J].醫(yī)學理論與實踐，2006，19（5）：497-499.LIU Guo-hui，YAO dan-dan，LU Jia-yi，et al.The effect mechanism of Gynostemma Pentaphyllum Makino to hippoocampus in aged rats induced by D-galactose[J].Journal Medicine Theory&Practice，2006，19（5）：497-499.（in Chinese）

[7]Chen Jung-chou，Lu Kung-wen，Tsai M L，et al.Gypenosides induced G0/G1 arrest via CHk2 and apoptosis through endoplasmic reticulum stress and mitochondria-dependent pathways in human tongue cancer SCC-4 cells[J].Oral Oncology，2009，45（3）：273-283.

[8]Schild L，Chen Bing-huei，Makarov P，et al.Selective induction of apoptosis in glioma tumour cells by a Gynostemma pentaphyllum extract[J].Phytomedicine，2010，17（8）：589-597.

[9]Nguyen P H，Gauhar R，Hwang S L，et al.New dammarane-type glucosides as potential activators of AMP-activated protein kinase （AMPK）from Gynostemma pentaphyllum[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry，2011，19（21）：6254-6260.

[10]Tom H H，Valentina R N，Noeris K S，et al.A novel LXR-α activator identified from the natural product Gynostemma pentaphyllum[J].Biochemical Pharmacology，2005，70（9）：1298-1308.

[11]陳忠仁，張永田.福建省絞股藍資源植物[J].亞熱帶植物通訊，1992，21（1）：51-53.CHEN Zhong-ren，ZHANG Yong-tian.The natural resource of Gynostemma pentaphyllum in Fujian province[J].Subtropical Plant Science，1992，21（1）：51-53.（in Chinese）

[12]蔣偉哲，周燕文，李錦燊.廣西 6 種絞股藍中總皂苷的含量比較[J].中國藥業(yè)，2006，15（3）：26-27.JIANG Wei-zhe，ZHOU Yan-wen，LI Jin-shen.Comparision of total saponin contents in gynostemma cultivated of Guangxi[J].China Pharmaceuticals，2006，15（3）：26-27.（in Chinese）

[13]劉學湘，陳建偉.中藥有效成分生物轉化的研究進展[J].食品與生物技術學報，2008，27（2）：14-18.LIU Xue-xiang，CHEN Jian-wei.Research progress of chinese medicine effective component biotransformation[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2008，27（2）：14-18.（in Chinese）