HBV前S基因芯片檢測(cè)研究

余 蓉，邱少紅，李傳珩，張 勤，簡(jiǎn)維國(guó) (石首市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科， 湖北 石首 434400)

HBV前S基因芯片檢測(cè)研究

余 蓉，邱少紅，李傳珩，張 勤，簡(jiǎn)維國(guó) (石首市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科， 湖北 石首 434400)

新發(fā)明的芯片法檢測(cè)前S基因缺失突變發(fā)現(xiàn)一個(gè)乙肝攜帶者體內(nèi)往往存在多種突變，傳統(tǒng)分析方法耗時(shí)耗力。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，單個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物足夠?qū)η癝基因缺失分型。個(gè)體基因克隆后的產(chǎn)物用于前S芯片法雜交檢測(cè)，比傳統(tǒng)DNA測(cè)序法省時(shí)經(jīng)濟(jì)。前S芯片為0.7cm2大小的尼龍膜，對(duì)于沒(méi)有測(cè)序儀器的臨床機(jī)構(gòu)來(lái)講更方便經(jīng)濟(jì)。同時(shí)，芯片自動(dòng)檢測(cè)多種前S克隆，更適合于對(duì)慢性乙肝病毒攜帶者大范圍的突變掃描。雙盲法對(duì)比芯片法和傳統(tǒng)測(cè)序法，二者對(duì)前S突變的檢出率相近。

前S基因缺失突變；傳統(tǒng)基因序列檢測(cè)法；芯片法

慢性乙肝病毒感染是世界范圍內(nèi)原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)病的一個(gè)重要原因[1-6]，血液或體液為其主要傳播途徑。在癌癥發(fā)展之前乙肝病毒數(shù)十年的持續(xù)存在，多在40歲及以上病人發(fā)生乙肝相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌[6-7]。慢性乙肝病毒攜帶者長(zhǎng)期對(duì)病毒的控制可能對(duì)原發(fā)性肝癌的發(fā)生起到抑制作用。用于檢測(cè)慢性乙肝病毒攜帶者體內(nèi)病毒狀況的乙型肝炎病毒標(biāo)記物包括DNA滴度、乙肝病毒表面抗原、核心抗原、以及e抗原[7-8]。標(biāo)記物聯(lián)合檢測(cè)揭示了體內(nèi)病毒的復(fù)制情況以及宿主肝細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒數(shù)量。乙肝病毒活動(dòng)性復(fù)制以及高病毒滴度與乙肝病毒導(dǎo)致的肝臟病情如炎癥、纖維化、硬化和肝細(xì)胞癌的嚴(yán)重性相符[9]。

1 前S基因缺失突變而形成的大蛋白的發(fā)現(xiàn)

圖1 灰色部分標(biāo)示前S1和前S2突變部位，圖上的箭頭指示HBV基因的起始位點(diǎn)

19世紀(jì)90年代末兩種類型的因前S基因缺失突變而形成的大蛋白被發(fā)現(xiàn)，并被認(rèn)為與原發(fā)性肝細(xì)胞癌高度相關(guān)[10-11]。大蛋白主要表達(dá)在慢性乙肝病毒感染的后期，病毒基因組整合進(jìn)入宿主染色體以后[12-15]。這種突變基因翻譯而成的大蛋白首先在毛玻璃樣肝細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，組織學(xué)證據(jù)提示其多出現(xiàn)在慢性乙肝病毒感染者及原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者體內(nèi)[16]。前S突變形成的大蛋白與包括肝硬化和原發(fā)性肝癌在內(nèi)的嚴(yán)重肝臟疾病密切相關(guān)，可能原因是其參與了肝細(xì)胞癌變的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[17-25]。前S基因突變包括前S1和前S2兩種不同的突變(見(jiàn)圖1)。突變基因翻譯而成的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，引發(fā)了劇烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力[26]，進(jìn)而導(dǎo)致氧化毒性和DNA損傷[27]。同時(shí)存在非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，突變的前S2蛋白能夠延長(zhǎng)肝細(xì)胞壽命[28]。與原癌基因(c-jun)激活域結(jié)合蛋白1(JAB1)作用，誘導(dǎo)腫瘤抑制基因(p27kip1)降解，細(xì)胞周期進(jìn)行，細(xì)胞增長(zhǎng)[30]。因此認(rèn)為在乙肝相關(guān)的肝細(xì)胞癌發(fā)生過(guò)程中前S突變很關(guān)鍵。

2 前S基因缺失掃描對(duì)慢性乙肝病毒攜帶者診治的重要性

圖2 前S基因芯片 7mm×10mm/w 包含42個(gè)核苷酸探針

圖3 A顯示野生型大蛋白基因；B顯示前S1突變蛋白基因，探針6、7信號(hào)陰性；C顯示前S2突變蛋白基因，信號(hào)12、13信號(hào)陰性

在發(fā)現(xiàn)前S突變以后，眾多相關(guān)研究結(jié)果報(bào)道了其在慢性乙肝病毒攜帶者體內(nèi)的廣泛存在[17-25]。突變的前S形成的大蛋白，尤其是前S2蛋白與包括肝癌在內(nèi)的乙肝相關(guān)疾病的嚴(yán)重性高度關(guān)聯(lián)。前S基因缺失突變掃描對(duì)于慢性乙肝病毒攜帶者診治尤其重要，同時(shí)與其他乙肝標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)以評(píng)估發(fā)生原發(fā)性肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。

慢性乙肝病毒攜帶者體內(nèi)前S基因突變的確認(rèn)通常需要許多實(shí)驗(yàn)步驟，因?yàn)橥蛔兊那癝基因來(lái)源于野生的前S基因，一個(gè)攜帶者體內(nèi)可能存在許多前S自然突變，需要逐一克隆和測(cè)序，直接導(dǎo)致大樣本檢測(cè)的困難。新發(fā)明的檢測(cè)方法，省略傳統(tǒng)的DNA測(cè)序步驟，縮短程序使檢測(cè)時(shí)間由7d減少至3d。

DNA序列分析結(jié)果表明急性乙肝感染患者的前S基因突變率相對(duì)較低(為7％)，乙肝持續(xù)感染病程中前S基因缺失突變率逐漸上升至37％，在原發(fā)性肝癌患者中突變率升至60％，乙肝攜帶者基因組內(nèi)的前S突變易化了肝癌的發(fā)展。

前S基因芯片包含42個(gè)基因探針(見(jiàn)圖2)，檢測(cè)野生型大蛋白基因，前S1基因突變蛋白，前S2基因突變蛋白[27]。野生型能與芯片上所有探針雜交(見(jiàn)圖3A)，前S1突變顯示信號(hào)6、7探針缺失(見(jiàn)圖3B)，前S2突變顯示探針12、13缺失(見(jiàn)圖3C)。

3 前S基因芯片檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)

傳統(tǒng)基因序列檢測(cè)法檢測(cè)前S1基因 21個(gè)克隆，前S1基因芯片分析檢測(cè)19個(gè)；前S1缺失突變檢出率傳統(tǒng)基因序列檢測(cè)法為70％，芯片法為65％。對(duì)比結(jié)果顯示芯片法可以提供敏感性分析。

新發(fā)明的芯片法檢測(cè)前S基因缺失突變發(fā)現(xiàn)一個(gè)乙肝攜帶者體內(nèi)往往存在多種突變，傳統(tǒng)分析方法耗時(shí)耗力。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，單個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物足夠?qū)η癝基因缺失分型。個(gè)體基因克隆后的產(chǎn)物用于前S芯片法雜交檢測(cè)，比傳統(tǒng)DNA測(cè)序法省時(shí)經(jīng)濟(jì)。前S芯片為0.7cm2大小的尼龍膜，對(duì)于沒(méi)有測(cè)序儀器的臨床機(jī)構(gòu)來(lái)講更方便經(jīng)濟(jì)。同時(shí)，芯片自動(dòng)檢測(cè)多種前S克隆，更適合于對(duì)慢性乙肝病毒攜帶者大范圍的突變掃描。雙盲法對(duì)比芯片法和傳統(tǒng)測(cè)序法，二者對(duì)前S突變的檢出率相近。

研究結(jié)果表明急性乙肝感染HBV病毒高滴度，前S缺失突變率低；慢性乙肝感染后期，HBV病毒滴度小，前S缺失突變率較急性期明顯升高，至乙肝相關(guān)原發(fā)性肝癌階段，突變率甚至高至60％。提示前S缺失發(fā)生在HBV長(zhǎng)期持續(xù)感染階段，最終成為乙肝病毒攜帶者。因此假設(shè)前S突變是肝臟癌變的重要因素，前S在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的聚集導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力增加以及氧化毒性，引起DNA損傷和突變[26-27]。有研究表明前S2突變引起細(xì)胞周期素A過(guò)表達(dá)，引發(fā)細(xì)胞周期開(kāi)始，細(xì)胞增長(zhǎng)[28-29]。結(jié)果表明，突變大蛋白尤其是前S2型參與了癌癥的發(fā)生過(guò)程。因此對(duì)于原發(fā)性肝癌的高危人群慢性乙肝攜帶者，檢測(cè)前S基因缺失突變很重要。

除外前S基因缺失，HBV一系列標(biāo)志物例如HBV 滴度檢測(cè)、HbeAg也與慢性乙肝攜帶者罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[30-31]。乙肝病毒復(fù)制引起肝臟損傷、炎癥，釋放腫瘤壞死因子，易化了纖維化的進(jìn)程以及肝細(xì)胞的增殖[7-8]。HBV蛋白HBX能與許多宿主因子交互反應(yīng)，是病毒原癌蛋白[32-33]。HBX與細(xì)胞啟動(dòng)子結(jié)合反應(yīng)，作用于反式調(diào)控元件[34]；同時(shí)調(diào)節(jié)蛋白酶體的功能，調(diào)控細(xì)胞降解以及病毒蛋白的合成[35]。因此假設(shè)前S突變加強(qiáng)了HBX的有害作用，引起細(xì)胞增殖和基因組的不穩(wěn)定性，從而易化了肝細(xì)胞癌的發(fā)生。

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[編輯] 何 勇

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.02.035

R349.6

A

1673-1409(2012)02-R073-04

2011-11-30

余蓉(1969-)，女，湖北監(jiān)利人，副主任檢驗(yàn)技師，碩士，主要從事臨床免疫學(xué)及質(zhì)量控制工作。