骨髓基質(zhì)細(xì)胞及在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療研究中的應(yīng)用前景

謝三平，姚長江 (長江大學(xué)荊州臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 湖北 荊州 434020)

骨髓基質(zhì)細(xì)胞及在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療研究中的應(yīng)用前景

謝三平，姚長江 (長江大學(xué)荊州臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 湖北 荊州 434020)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的再生仍然是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的難題，因此很多研究者開始探索干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可行性，而骨髓基質(zhì)細(xì)胞因自身優(yōu)勢，倍受研究者親睞，本文重點(diǎn)就骨髓基質(zhì)細(xì)胞及其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

骨髓基質(zhì)細(xì)胞； 干細(xì)胞移植； 神經(jīng)系統(tǒng)疾病

由于成熟的神經(jīng)元是不可再生細(xì)胞，一旦受損后周圍神經(jīng)組織對其修復(fù)能力將極其有限，故其相關(guān)功能將永久性缺省或缺失，所以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS) 損傷性或退行性病變造成的神經(jīng)功能障礙將會長期影響患者的生存及生活質(zhì)量。如何治療修復(fù)受損的神經(jīng)組織，恢復(fù)患者的神經(jīng)功能一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域廣為關(guān)注和困惑的問題。自1987年Gensburger[1]從胚胎鼠中培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞后，揭開了神經(jīng)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的序幕，從而為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療研究開辟了一條嶄新的途徑。目前，神經(jīng)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的探索已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。但由于作為細(xì)胞移植治療的神經(jīng)干細(xì)胞都是來源于胚胎或胎兒的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，存在可用細(xì)胞數(shù)量有限、供體材料不易獲得、倫理道德等問題限制了其在臨床研究中的應(yīng)用。來源于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞不僅無此限制，而且具有間充質(zhì)-神經(jīng)組織轉(zhuǎn)化的可塑性，因此備受神經(jīng)學(xué)者的青睞。本文重點(diǎn)就骨髓基質(zhì)干細(xì)胞及其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)特性及其分離方法

2 骨髓基質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞分化潛能的體外研究

BMSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞的體外研究主要集中于化學(xué)試劑或是同神經(jīng)組織細(xì)胞共同培養(yǎng)誘導(dǎo)?；瘜W(xué)試劑誘導(dǎo)有抗氧化劑和神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)等，如全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid，RA)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor，BDNF)等。Sanchez-Ramos等[10]在研究BMSCs的神經(jīng)細(xì)胞分化潛能時(shí)發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞抑制因子(leucocyte inhibitory factor，LIF)可促使BMSCs向成纖維細(xì)胞分化，但不能誘導(dǎo)其分化為神經(jīng)細(xì)胞，而BMSCs經(jīng)RA和BDNF在體外共同誘導(dǎo)后發(fā)生了形態(tài)學(xué)的轉(zhuǎn)化，由大扁平細(xì)胞轉(zhuǎn)化成形態(tài)較小的紡錘形細(xì)胞，并形似神經(jīng)細(xì)胞有長突起延伸于兩端，經(jīng)免疫熒光檢測也證實(shí)有少量細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性表面標(biāo)志nestin、NeuN和GFAP蛋白，細(xì)胞裂解物經(jīng)Western blots檢測也發(fā)現(xiàn)有nestin、NeuN和GFAP蛋白的表達(dá)。這些現(xiàn)象說明BMSCs有可能經(jīng)體外誘導(dǎo)可分化為具有神經(jīng)細(xì)胞特異性表面標(biāo)志的神經(jīng)細(xì)胞。將β-半乳糖苷酶基因標(biāo)記的BMSCs同胚鼠中腦神經(jīng)細(xì)胞在含RA和BDNF的神經(jīng)組織細(xì)胞培養(yǎng)液中共同培養(yǎng)2周后免疫組織化學(xué)檢測大約有2％～5％的β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞表達(dá)NeuN[10]，明顯高于單獨(dú)培養(yǎng)出的BMSCs。同樣綠色熒光標(biāo)記的BMSCs同胚鼠中腦神經(jīng)細(xì)胞在含RA和BDNF的神經(jīng)組織細(xì)胞培養(yǎng)液中共同培養(yǎng)1周后免疫組織化學(xué)檢測示骨髓基質(zhì)來源的細(xì)胞中NeuN+細(xì)胞為2％～4％，GFAP+細(xì)胞為5％～8％，NeuN+細(xì)胞呈卵圓形或紡錘形，有雙極突起，形似未成熟的神經(jīng)元樣細(xì)胞，位于微管締合蛋白-2(microtubule-associated protein-2,MAP-2)陽性的胚鼠中腦神經(jīng)細(xì)胞周圍，但即使明確表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志的BMSCs也未見MAP2表達(dá)；大部分GFAP+細(xì)胞呈卵圓形或紡錘形，但其突起較NeuN+細(xì)胞的短，少部分GFAP+細(xì)胞形似神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞呈不規(guī)則形[10]。BMSCs同胚鼠中腦神經(jīng)細(xì)胞共同培養(yǎng)后NeuN+細(xì)胞和GFAP+細(xì)胞表達(dá)率均比單純化學(xué)誘導(dǎo)增加1倍以上，說明BMSCs在向神經(jīng)樣細(xì)胞定向分化過程中，除細(xì)胞因子和營養(yǎng)因子的作用外，細(xì)胞間的相互作用也是不容忽視的。神經(jīng)樣細(xì)胞不表達(dá)成熟神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志蛋白MAP2，可能是因誘導(dǎo)時(shí)間不夠，因?yàn)樯窠?jīng)母細(xì)胞分化為功能性神經(jīng)細(xì)胞需要數(shù)月時(shí)間。Abouelfetouh等[11]也同樣研究發(fā)現(xiàn)BMSCs同海馬組織碎片共同培養(yǎng)第3天，神經(jīng)元樣細(xì)胞所占比例為31.4％±2.79％，軸突樣突起平均長56μ，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，神經(jīng)元樣細(xì)胞所占比例逐漸降低，而軸突樣突起卻逐漸增長，第14天時(shí)神經(jīng)元樣細(xì)胞所占比例為6.8％±0.8％，軸突樣突起已在細(xì)胞間交織成網(wǎng)很難測量，培養(yǎng)基中添加RA后可促進(jìn)神經(jīng)元樣細(xì)胞數(shù)的增加。免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的現(xiàn)象，那些突起較長相對較成熟的細(xì)胞并不表達(dá)NeuN表面抗原，而那些突起較短未成熟的細(xì)胞卻NeuN表面抗原呈陽性，由BMSCs分化來的形態(tài)上類似神經(jīng)元的細(xì)胞中9.6％±1.7％表達(dá)NeuN抗原，所有神經(jīng)元樣細(xì)胞不表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞特征抗原GFAP和Iba1，而且同時(shí)觀察到這種神經(jīng)元樣細(xì)胞分化僅發(fā)生在海馬組織粹片邊緣。這也證實(shí)BMSCs具有神經(jīng)細(xì)胞分化潛能，且分化動(dòng)力受誘導(dǎo)因子及周圍微環(huán)境(與神經(jīng)組織的直接接觸)雙重影響。在Wislet-Gendebien[12]將BMSCs與小腦顆粒細(xì)胞共同培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)成體骨髓基質(zhì)細(xì)胞不僅能表達(dá)神經(jīng)元特異抗原，還可與γ-氨基丁酸、甘氨酸、谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生單程動(dòng)作電位，說明BMSCs可分化為能產(chǎn)生動(dòng)作電位具有功能性的神經(jīng)樣細(xì)胞，但BMSCs分化為神經(jīng)樣細(xì)胞需要兩個(gè)前提條件：①BMSCs表達(dá)nestin蛋白；② BMSCs與神經(jīng)細(xì)胞直接接觸后產(chǎn)生的信號整合作用。Tseng等[13]同樣也證實(shí)，BMSCs在體外經(jīng)生長因子和化學(xué)處理后，可向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，表達(dá)神經(jīng)元特異標(biāo)記如神經(jīng)絲蛋白NF-H(35.7±8.1％)、β-微管蛋白Ⅲ(21.8±6.3％)、tau(90.4±7.5％)，還有少量神經(jīng)樣細(xì)胞(lt;0.1％)可分泌神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)。關(guān)于BMSCs神經(jīng)細(xì)胞分化潛能的很多研究都證實(shí)BMSCs可在體外誘導(dǎo)為神經(jīng)樣細(xì)胞，并具有某些神經(jīng)細(xì)胞樣功能如分泌神經(jīng)遞質(zhì)、與神經(jīng)遞質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生動(dòng)作電位等。

3 骨髓基質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究應(yīng)用

因?yàn)锽MSCs具有神經(jīng)細(xì)胞分化潛能，所以已經(jīng)作為理想的種子細(xì)胞應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療研究中[14]。缺血性腦血管病是臨床常見疾病，具有較高的致死、致殘率，若發(fā)生不可逆性腦缺血將導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧性壞死，造成受損腦組織相關(guān)神經(jīng)功能永久性缺失，給患者的生存造成極大危害，因此如何修復(fù)受損腦組織恢復(fù)患者的神經(jīng)功能是治療缺血性腦血管病的關(guān)鍵。Shen等[15]曾在探索BMSCs移植治療大腦中動(dòng)脈閉塞 (middle cerebral artery occlusion MCAO)腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植治療2周后腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷纳窠?jīng)缺失癥狀開始得到改善，并且這種治療效應(yīng)至少可持續(xù)1年，經(jīng)原位雜交反應(yīng)也證實(shí)移植后的細(xì)胞可在宿主腦內(nèi)存活并部分(22.3％±1.95％)表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異蛋白GFAP、部分(16.8％±2.13％)表達(dá)神經(jīng)元特異蛋白MAP-2，可增加缺血組織周圍突觸囊泡蛋白表達(dá)明顯減輕突觸缺失。其結(jié)果提示BMSCs腦內(nèi)移植后可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，替代修復(fù)受損的神經(jīng)組織。Chen等[16]研究BMSCs腦內(nèi)移植治療短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠模型時(shí)也證實(shí)，移植后的BMSCs不僅能夠存活而且向損傷腦組織周圍遷移，并部分細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)志物，減輕腦白質(zhì)的損傷，促進(jìn)腦皮質(zhì)內(nèi)β-Ⅲ-tubulin分泌，明顯改善MCAO造成的皮質(zhì)功能缺失癥狀。BMSCs在移植治療腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究中顯現(xiàn)出的突出效果使其成為目前研究熱點(diǎn)。

帕金森病是老年人中一種常見的慢性、進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理特征主要是黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元退行性變、數(shù)目減少，導(dǎo)致紋狀體內(nèi)多巴胺遞質(zhì)水平下降，引起震顫、肌強(qiáng)直和運(yùn)動(dòng)遲緩等錐體外系癥狀。Lu[17]等曾利用腺相關(guān)病毒載體將多巴胺生成限速酶-酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因?qū)隑MSCs，然后將表達(dá)TH基因的BMSCs移植到帕金森病模型鼠的紋狀體內(nèi)后觀察發(fā)現(xiàn)治療組阿撲嗎啡誘導(dǎo)的不對稱旋轉(zhuǎn)癥狀較對照組明顯減輕，6周后免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)TH基因主要在移植點(diǎn)周圍表達(dá)，高效液相色譜儀及電化學(xué)檢測也證實(shí)TH基因修飾的BMSCs紋狀體內(nèi)移植可明顯增加移植點(diǎn)周圍多巴胺遞質(zhì)水平。證實(shí)BMSCs可作為帕金森病基因治療的有效載體細(xì)胞，為帕金森病的基因治療提供了前提條件。Zhang等[18]先將BMSCs經(jīng)體外誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞，然后利用基因整合技術(shù)將TH基因轉(zhuǎn)入其中，并移植入帕金森病大鼠模型腦室及紋狀體內(nèi)，10周后觀察發(fā)現(xiàn)PD模型的不對稱旋轉(zhuǎn)癥狀明顯減輕且活動(dòng)能力得到顯著改善，同對照組比較，紋狀體內(nèi)移植組多巴胺水平提高46.6％，腦室內(nèi)移植組巴胺水平提高33％，而且觀察到移植細(xì)胞沿著基底神經(jīng)纖維發(fā)生遷移。這進(jìn)一步證實(shí)了BMSCs作為種子細(xì)胞在帕金森病治療研究中的應(yīng)用價(jià)值。而且還有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)BMSCs具有多巴胺能神經(jīng)元分化潛能[19]。所有這些實(shí)驗(yàn)研究均為BMSCs作為干細(xì)胞移植治療帕金森病提供了理論依據(jù)。

阿爾茨海默病又名老年性癡呆，是引起老年人癡呆的最常見原因，其特征性病理改變主要有老年斑的形成、神經(jīng)元纖維纏結(jié)及神經(jīng)元缺失等。AD患者由于進(jìn)行性智能障礙，最終導(dǎo)致完成喪失生活自理能力，給患者及家人造成嚴(yán)重影響，而目前又無有效的治療手段，所以設(shè)法阻止或延緩神經(jīng)元的缺失，緩解患者的智能衰退是治療的關(guān)鍵。Wu等[20]將綠色熒光蛋白標(biāo)記的BMSCs移植入β-淀粉樣蛋白所致AD大鼠模型海馬內(nèi)，2周后水鏡迷津測驗(yàn)證實(shí)BMSCs移植治療組的認(rèn)知能力得到明顯改善，剛果紅著色顯示AD模型腦內(nèi)神經(jīng)元減少，海馬CA1區(qū)尤為明顯，而BMSCs移植治療后腦內(nèi)神經(jīng)元雖然不能達(dá)到正常但還是有所增加，熒光視蹤和免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞在腦內(nèi)存活并遷移而且可能轉(zhuǎn)化為膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyl transferase,ChAT)陽性神經(jīng)元。Lee等[21]也研究證實(shí)BMSCs腦內(nèi)移植后，可促進(jìn)腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性，減少β-淀粉樣蛋白在急性誘導(dǎo)的AD小鼠模型腦內(nèi)的存積，減輕β-淀粉樣蛋白對神經(jīng)元的損傷，提示了BMSCs治療AD的可能性。

4 骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可能機(jī)制

對于骨髓基質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)修復(fù)作用機(jī)制目前主要傾向于認(rèn)為可能有兩方面原因：①分化為神經(jīng)細(xì)胞替代修復(fù)缺損的神經(jīng)組織，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)BMSCs可向神經(jīng)細(xì)胞分化[11，15]，并可能分泌神經(jīng)遞質(zhì)[19]、與神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生動(dòng)作電位[12]。Tropel等[22]也研究發(fā)現(xiàn)BMSCs不僅可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，而且分化后的細(xì)胞具有神經(jīng)元樣的功能，可與谷氨酸、藜蘆定堿反應(yīng)增加胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度，而且這種效應(yīng)可分別被N-甲基-D-門冬氨酸受體阻斷劑、河豚毒素所阻斷，同樣發(fā)現(xiàn)BMSCs源性神經(jīng)樣細(xì)胞可與多巴胺反應(yīng)增加胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度，所有這些均證實(shí)BMSCs源性神經(jīng)樣細(xì)胞表達(dá)功能性神經(jīng)遞質(zhì)受體，可作為干細(xì)胞用于神經(jīng)系統(tǒng)的治療。Cogle等[23]在一項(xiàng)BMSCs腦內(nèi)移植后的臨床回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，BMSCs可在腦內(nèi)長期存活，并可轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，盡管發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞數(shù)量很少，但還是說明BMSCs有可能通過神經(jīng)組織轉(zhuǎn)化來替代修復(fù)缺失的神經(jīng)細(xì)胞，恢復(fù)其缺損的神經(jīng)功能。②BMSCs可能通過自分泌或刺激周圍神經(jīng)組織分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子，減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活和再生。Garcia等[24]體外培養(yǎng)BMSCs至第6代時(shí)提取總的RNA后加入特異引物，RT-PCR反應(yīng)證實(shí)BMSCs表達(dá)NGF和GDNF。 Yaghoobi等[25]也研究證實(shí)BMSCs在分化為神經(jīng)樣細(xì)胞前后均表達(dá)NGF和BDNF。Mahmood等[26]研究發(fā)現(xiàn)BMSCs通過靜脈移植后可向損傷腦組織處遷移，并明顯改善其神經(jīng)功能，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)證實(shí)BMSCs可增加腦組織內(nèi)NGF和BDNF的表達(dá)，因而證明BMSCs有可能是通過增加腦組織內(nèi)相關(guān)神經(jīng)生長因子如NGF、BDNF等來保護(hù)受損的神經(jīng)組織、降低神經(jīng)功能缺損。

5 尚存的問題與展望

由于可取材于自體，來源方便，且增殖分化能力強(qiáng)，可避免細(xì)胞數(shù)量不足、免疫排斥、倫理道德的限制等自身優(yōu)勢，同時(shí)又具有跨胚層分化潛能，可向神經(jīng)細(xì)胞分化等特性，所以BMSCs已被作為理想的種子細(xì)胞應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療研究中。體內(nèi)外大量實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)BMSCs具有神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化潛能，表現(xiàn)出某些神經(jīng)細(xì)胞功能特征，如分泌神經(jīng)遞質(zhì)[19]、與神經(jīng)遞質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生動(dòng)作電位[12]等，且在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療研究中取得了理想的療效，對缺損的神經(jīng)功能具有治療修復(fù)作用。但同時(shí)BMSCs應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中還存在諸多問題尚未解決。首先，目前還未發(fā)現(xiàn)BMSCs的特異性標(biāo)志，對BMSCs的鑒別主要依靠其形態(tài)、功能特征及培養(yǎng)中出現(xiàn)的分化表型來推斷，得到的細(xì)胞神經(jīng)分化潛能各異，因此如何純化鑒定得到神經(jīng)細(xì)胞分化潛能最強(qiáng)的單一的BMSCs還是一個(gè)有待解決的問題。其次，BMSCs移植后改善神經(jīng)功能的確切機(jī)制還不清楚，并且關(guān)于BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的研究也僅僅只是依靠其形態(tài)特征及少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞特異標(biāo)志來鑒別，而BMSCs能否真正分化為神經(jīng)細(xì)胞、發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞功能、與宿主的神經(jīng)組織發(fā)生有效整合、修復(fù)缺失的神經(jīng)功能等還未得到充分證明[27]。再者，BMSCs的安全性問題還有待進(jìn)一步證實(shí)，BMSCs體內(nèi)移植后是否會發(fā)生基因突變，引起致瘤性[28]目前還無可靠證據(jù)。最后，利用BMSCs進(jìn)行基因治療時(shí)也面臨著轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的靶向性及基因表達(dá)的持續(xù)性和可控性等問題。盡管關(guān)于BMSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究還存在許多未知因素，但BMSCs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療研究中顯示出來的客觀效果及隨著研究的不斷深入，BMSCs有望成為神經(jīng)疾病患者的福音。

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[編輯] 何 勇

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.02.034

R741

A

1673-1409(2012)02-R068-05

2011-11-29

謝三平(1980-),男,湖北監(jiān)利人，醫(yī)師，碩士，主要從事神經(jīng)內(nèi)科臨床工作。