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    Caspase-3在小鼠毛囊周期中的表達(dá)及激活規(guī)律的研究

    2012-11-09 09:39:54章旭日雷明星連小華
    中國(guó)醫(yī)藥指南 2012年9期
    關(guān)鍵詞:母質(zhì)球部周期性

    章旭日 雷明星 連小華*

    (1 長(zhǎng)沙市賀龍?bào)w育運(yùn)動(dòng)學(xué)校,湖南 長(zhǎng)沙 400100;2 第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞生物學(xué)教研室,重慶 400038)

    程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death,PCD)也稱細(xì)胞凋亡,在生物體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、器官的生長(zhǎng)發(fā)育、防御外在及內(nèi)在傷害以及防止癌細(xì)胞的擴(kuò)散等方面均起著非常重要的作用[1]。

    毛囊作為表皮的附屬器官,在出生后顯示出周期性的活動(dòng)特性[2],包括生長(zhǎng)期,退化期和靜止期[3]。凋亡在維持毛囊的周期性活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用,在退化期初期,一系列的凋亡信號(hào)通路被激活,有關(guān)促進(jìn)與抑制凋亡基因之間的平衡調(diào)控被打破,一些內(nèi)源性或外源性的凋亡因子開始誘導(dǎo)凋亡信號(hào)通路激活,毛囊的凋亡迅速發(fā)生[4,5]。

    在毛囊凋亡的各種信號(hào)通路中,caspase家族的各類分子相互級(jí)聯(lián),在凋亡的發(fā)生中起著重要的作用。而Caspase-3處于凋亡有序級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游,是依賴Caspase凋亡機(jī)制中起執(zhí)行者核心作用的關(guān)鍵分子,是細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵步驟及一切凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路[6,7],它的活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段標(biāo)志。Caspase-3發(fā)揮活性需要通過剪切pro-Caspase-3形成活性形式的Active Caspase-3。Active Caspase-3的形成是判斷細(xì)胞凋亡是否執(zhí)行的關(guān)鍵。

    Caspase-3及其激活體廣泛的表達(dá)在毛囊的各類細(xì)胞中,但目前對(duì)于系統(tǒng)的研究毛囊一個(gè)周期的Caspase-3及其激活體Active Caspase-3的表達(dá)情況知之甚少。由于Caspase-3對(duì)于毛囊周期性維持的重要特性,我們通過免疫組織化學(xué)系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn),Caspase-3及其激活體表達(dá)于毛囊的各個(gè)時(shí)期,表現(xiàn)為生長(zhǎng)期較弱,而退化期很強(qiáng),靜止期較弱。而在毛囊一個(gè)周期中,Active Caspase-3在毛囊的各個(gè)時(shí)相點(diǎn)的表達(dá)量均低于Caspase-3的表達(dá)。我們的研究證明,Caspase-3及其激活體在毛囊中的表達(dá)具有高度的時(shí)空特異性,而毛囊的凋亡活動(dòng)與Caspase-3及其激活體的表達(dá)呈正相關(guān)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑及儀器

    Caspase-3抗體(santa craze公司),Active Caspase-3抗體(北京博奧森生物科技有限公司),免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中衫生物技術(shù)公司),DAB顯色試劑盒(北京中衫生物技術(shù)公司)。石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    取出生后11d,16d,18d,24d的C57BL/6小鼠各5只,體質(zhì)量分別為130~150、150~170、170~200、200~250g。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 取材

    取各鼠齡小鼠背皮4%多聚甲醛固定過夜,常規(guī)梯度酒精脫水,二甲苯透明,浸蠟包埋。

    1.3.2 免疫組織化學(xué)

    5um石蠟切片二甲苯透明,梯度酒精水合,3%H2O2室溫封閉15min,去除內(nèi)源性過氧化物酶活性。檸檬酸微波抗原修復(fù)。滴加一抗,4℃孵育過夜。PBS洗,滴加二抗37℃孵育30 min,PBS洗,DAB顯色。

    2 結(jié) 果

    2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)Caspase-3在B6小鼠毛囊周期中的表達(dá)

    在小鼠出生后的11d(圖1A,A’),Caspase-3主要表達(dá)與毛囊的毛球部和毛球部的上段的內(nèi)外根鞘細(xì)胞中,而在小鼠毛囊處于退化期的16d(圖1B,B’)和18d(圖1C,C’),Caspase-3呈現(xiàn)強(qiáng)烈的核表達(dá)于毛囊的各類細(xì)胞中,特別是在內(nèi)外根鞘中的表達(dá)量要明顯高于在生長(zhǎng)期的水平;當(dāng)小鼠毛囊進(jìn)入了靜止期(圖1D,D’),Caspase-3依然表達(dá)于毛干的外圍。而毛囊的毛乳頭細(xì)胞在各個(gè)時(shí)期都很少有Caspase-3的表達(dá)。

    2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)Caspsae-3激活體Active Caspase-3在小鼠毛囊周期中的表達(dá)

    在小鼠毛囊各時(shí)期中,激活體呈明顯的核表達(dá)于毛囊的各類細(xì)胞中。在B6小鼠出生后的11d,激活體在B6小鼠主要表達(dá)在毛囊的毛母質(zhì),內(nèi)外根鞘幾乎沒有表達(dá);在B6小鼠出生后的16d(圖1B,B’),毛囊剛進(jìn)入退化期,激活體在小鼠毛囊的毛球中表達(dá)強(qiáng)烈,而在內(nèi)外根鞘也有部分細(xì)胞開始表達(dá);在小鼠出生后的18d,毛囊正值退化期,激活體非常明顯的表達(dá)于毛囊的毛母質(zhì),而在內(nèi)外根鞘的表達(dá)非常強(qiáng)烈,遠(yuǎn)高于生長(zhǎng)期和退化期初期的水平。在靜止期,激活體少量的表達(dá)于毛干的外圍部位,且表達(dá)量處于各時(shí)期中最低水平。同樣,毛囊的毛乳頭細(xì)胞很少有激活體陽性表達(dá)。

    3 討 論

    圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)C57BL/6 鼠各個(gè)時(shí)期毛囊中Caspase-3表達(dá)

    圖2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)C57BL/6 鼠各個(gè)時(shí)期毛囊中Active Caspase-3表達(dá)

    毛囊周期性的維持需要凋亡因子的參與,Caspase-3作為凋亡的關(guān)鍵分子,在毛囊發(fā)生凋亡時(shí)必不可少。研究顯示Caspase-3廣泛的表達(dá)于毛囊的各個(gè)部位中,并在要執(zhí)行凋亡的時(shí)候?qū)崿F(xiàn)激活,形成激活體Active Caspase-3。而以往對(duì)于Caspase-3在毛囊中作用往往是作為一個(gè)凋亡的指標(biāo)而限制在某一個(gè)時(shí)相點(diǎn),并沒有進(jìn)行系統(tǒng)的研究。我們對(duì)C57BL/6這種最常規(guī)的小鼠為模型,用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)了Caspase-3及Active Caspase-3在小鼠出生后毛囊生長(zhǎng)期,退化期和靜止期的表達(dá)及激活情況。首先,在表達(dá)部位上,我們的研究與以往的研究并無不同。在毛囊中,Caspase-3及激活體均呈明顯的核表達(dá)于毛囊各類細(xì)胞中。在小鼠出生后毛囊處于生長(zhǎng)期中后期,Caspase-3主要表達(dá)在毛囊的毛母質(zhì)以及毛球部上段的內(nèi)外根鞘細(xì)胞中,而其激活體主要表達(dá)在毛母質(zhì)的細(xì)胞,在內(nèi)外根鞘細(xì)胞中表達(dá)很少,這說明了雖然內(nèi)外根鞘細(xì)胞有Caspase-3的表達(dá),但沒有被激活,所以其在生長(zhǎng)期中后期并不會(huì)有大量的凋亡發(fā)生。在小鼠出生后16d,毛囊處于退化期的初期,Caspase-3及其激活體在毛母質(zhì)和內(nèi)外根鞘都有表達(dá),而且要比生長(zhǎng)期高??傮w來說,Active Caspase-3在毛囊各個(gè)部位的表達(dá)都要低于Caspase-3的表達(dá),說明在退化期初期,毛囊已經(jīng)開始發(fā)生凋亡,但是凋亡并不是特別的明顯。而在小鼠出生后的18d,毛囊處于退化期的中后期,Caspase-3及其激活體除了在毛母質(zhì)表達(dá)增強(qiáng),在內(nèi)外根鞘的表達(dá)明顯要比退化期早期高,這表明Caspase-3在退化期中期大量被激活,從而內(nèi)外根鞘發(fā)生凋亡,也進(jìn)一步證實(shí)了在退化期,毛囊的毛球部萎縮,內(nèi)外根鞘縮短是跟Caspase-3的大量表達(dá)及激活是相關(guān)的。而在靜止期,兩者的表達(dá)都低于生長(zhǎng)期和退化期,但Caspase-3與其激活體的表達(dá)有著很大的區(qū)別,Caspase-3表達(dá)在毛干的外圍,包括干細(xì)胞所在的bulge區(qū),而其激活體Active Caspase-3在這些部位的表達(dá)并不明顯,說明Caspase-3并沒有被激活。毛囊的靜止期是一個(gè)相對(duì)靜止的時(shí)期,其增殖和凋亡活動(dòng)均不明顯,通過Caspase-3及其激活體的表達(dá)分析正好證實(shí)了這一現(xiàn)象。

    而在整個(gè)毛囊的周期中,Caspase-3及其激活體很少或者并沒有在毛乳頭細(xì)胞中表達(dá),這表明毛乳頭細(xì)胞在形成之后,其凋亡的進(jìn)程并不會(huì)隨著毛囊的周期而進(jìn)行。所以,到了靜止期,毛囊的細(xì)胞幾乎已經(jīng)凋亡完全,毛乳頭的細(xì)胞還能夠保留。與毛囊的其他結(jié)構(gòu)不同,毛乳頭細(xì)胞是真皮來源的細(xì)胞,有研究表明,毛乳頭細(xì)胞是毛囊的信號(hào)源,所以,毛囊凋亡的信號(hào)源也很有可能是來自毛乳頭細(xì)胞,而其自身的凋亡規(guī)律與毛囊的上皮型細(xì)胞并不相同,我們通過Caspase-3及其激活體在毛囊中的表達(dá)來看,也正好符合這個(gè)觀點(diǎn)。

    因此,認(rèn)為Caspase-3的表達(dá)具有高度的時(shí)空特異性,其表達(dá)與激活誘導(dǎo)毛囊細(xì)胞的凋亡,調(diào)節(jié)毛囊的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和周期性活動(dòng)。但是,毛乳頭的凋亡并不與毛囊的上皮型細(xì)胞的凋亡規(guī)律相同,毛乳頭如何調(diào)節(jié)上皮型細(xì)胞的凋亡,及其自身的凋亡規(guī)律有待進(jìn)一步深入的研究。

    本研究從毛囊的一個(gè)周期中從生長(zhǎng)期到靜止期四個(gè)時(shí)相點(diǎn)Caspase-3表達(dá)及其激活體的表達(dá)變化規(guī)律,系統(tǒng)闡明了Caspase-3及其激活對(duì)于毛囊維持其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及周期特性的重要性,為研究毛囊凋亡及周期性活動(dòng)提供了良好的基礎(chǔ)。

    [1]Marlon RS,Ruth SU,Ralf P.The hair follicle as a dynamic miniorgan[J].Cell Biol,2009,19(1):132-142.

    [2]Fuchs,E,Laura A.The hair cycle [J].Cell Sci,2006,119(2): 391-393.

    [3]Cédric B,Panagiota A,Sotiropoulou A.Dominant Role of the Hair Follicle Stem Cell Niche in Regulating Melanocyte Stemness [J].Cell Stem Cell,2010,6(1):95-96.

    [4]Rui Y,Matthew N.Poy,Markus S,et al.A skin microRNA promotes differentiation by repressing 'stemness' [J].Nature,2008,452(7184):225-229.

    [5]Masashi S,Lars-Inge L,David M,Hougaard,et al.Daunomycin accumulation and induction of programmed cell death in rat hair follicles [J].Cell Tissue Res,2009,337(2):429-438.

    [6]Natalia V,Botchkareva G,Ahluwalia S.Apoptosis in the Hair Follicle [J].J Investigat Dermatol,2006,126(2): 258–264.

    [7]Ryan RD,Carlos C,Michael R,et al.Hair follicle dermal papilla cells at a glance [J].J Cell Sci,2011,124(8):1179-1182.

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