哮喘急性期患兒血漿及誘導(dǎo)痰液標(biāo)志物的相關(guān)性研究

李 峰 朱薇薇 劉愛香 王 峻 畢玫榮 郭愛麗

（濟(jì)南市中心醫(yī)院兒科，山東 濟(jì)南 250013）

小兒哮喘（asthma）是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅公眾健康的一種慢性非特異性氣道炎癥性疾病[1]，涉及多種細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞（EOS）、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等相互作用的結(jié)果。哮喘的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，是多重因素作用的結(jié)果。炎性介質(zhì)在哮喘發(fā)病機(jī)制及防治中起著尤為重要的作用。本課題擬通過檢測哮喘患兒血漿及誘導(dǎo)痰液白細(xì)胞介素5（IL-5）、嗜酸粒細(xì)胞陽離子蛋白（ECP）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素8（IL-8）表達(dá)水平，探討誘導(dǎo)痰液IL-5、ECP、TNF-α、IL-8與哮喘發(fā)病的關(guān)系及其臨床意義進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 對象

哮喘組：依據(jù)全國兒童哮喘防治協(xié)作組制定標(biāo)準(zhǔn)[2]，選自2009年11月至2010年10月在我院診治的哮喘急性期患兒36例，男19例，女17例；年齡7～12歲。采集誘導(dǎo)痰前2周內(nèi)均未曾使用過糖皮質(zhì)激素及免疫增強(qiáng)或抑制劑藥物。入院后立即采集血清及誘導(dǎo)痰檢測誘導(dǎo)痰中IL-5、ECP、TNF-α及IL-8的水平。正常對照組26例，男15例，女11例；年齡7～12歲；為本科門診健康兒童,無過敏史、寄生蟲感染史、喘息病史及慢性呼吸道疾病。

1.2 方法

患兒組及對照組患兒均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血2mL，注入預(yù)冷的含50μL 10%草酸鈉（EDTA-2Na）的試管中，充分混勻后于4℃下離心20min，吸取血漿后置-20℃冰箱內(nèi)保存，同時采集誘導(dǎo)痰液于4℃下離心20min，吸取血漿后置-20℃冰箱內(nèi)保存，待測IL-5、ECP、TNF-α、IL-8。IL-5、IL-8、TNF-α、ECP濃度的測定采用ELISA法（IL-5、ECP、TNF-α、IL-8試劑盒購于廈門慧萊生物科技有限公司，IL-8試劑盒靈敏度50ng/L；TNF-α試劑盒靈敏度20ng/L；IL-5試劑盒靈敏度1ng/L；ECP試劑盒靈敏度100ng/L）。嚴(yán)格按說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

①哮喘患兒急性期外周血漿IL-5、ECP、TNF-α、IL-8水平高于對照組（P＜0.05）；②哮喘患兒急性期誘導(dǎo)痰液IL-5、ECP、TNF-α、IL-8水平顯著高于對照組（P＜0.01）；③哮喘患兒急性期誘導(dǎo)痰液IL-5、ECP、TNF-α、IL-8水平顯著高于血漿中的濃度（P＜0.01）。④喘患兒急性期血漿及誘導(dǎo)痰液炎性標(biāo)志物具有正相關(guān)性。見表1～表3和圖1～圖8。

圖1 正常組血清和誘導(dǎo)痰IL-5的相關(guān)性，r=0.789，P＜0.01

圖2 哮喘急性期血清和誘導(dǎo)痰IL-5的相關(guān)性，r=0.998，P＜0.01

圖3 正常組血清和誘導(dǎo)痰IL-8的相關(guān)性，r=0.04，P＜0.01

圖4 哮喘急性期血清和誘導(dǎo)痰IL-8的相關(guān)性，r=0.995，P＜0.01

圖5 正常組血清和誘導(dǎo)痰ECP的相關(guān)性，r=0.516，P＜0.01

圖6 哮喘急性期血清和誘導(dǎo)痰ECP的相關(guān)性，r=0.932，P＜0.01

圖7 正常組血清和誘導(dǎo)痰TNF-α的相關(guān)性，r=0.839，P＜0.01

圖8 哮喘急性期血清和誘導(dǎo)痰TNF-α的相關(guān)性，r=0.982，P＜0.01

表1 哮喘患兒與正常兒童血漿IL-5、ECP、TNF-α、IL-8水平比較（±s）

表1 哮喘患兒與正常兒童血漿IL-5、ECP、TNF-α、IL-8水平比較（±s）

n IL-5 ECP TNF-α IL-8哮喘急 36 27.56±20.02 4589±3068 409.8±325.9 1273±975.2性期組正常組 26 16.58±4.166 2945±599.2 234.4±86.59867.4±305.0 t =3.203 t=3.138 t=3.092 t=2.353 P=0.003 P=0.003 P=0.004 P=0.023

表2 哮喘患兒與正常兒童誘導(dǎo)痰IL-5、ECP、TNF-α、IL-8水平比較（±s）

表2 哮喘患兒與正常兒童誘導(dǎo)痰IL-5、ECP、TNF-α、IL-8水平比較（±s）

n IL-5 ECP TNF-α IL-8

表3 哮喘患兒血漿與誘導(dǎo)痰液IL-5、ECP、TNF-α、IL-8水平比較（±s）

表3 哮喘患兒血漿與誘導(dǎo)痰液IL-5、ECP、TNF-α、IL-8水平比較（±s）

n IL-5 ECP TNF-α IL-8哮喘組血漿 3627.56±20.024589±3068 409.8±325.9 1273±975.2誘導(dǎo)痰 3655.16±38.699179±5372 809.0±546.72572.6±1866.8 t=3.801 t=4.451 t=3.762 t=3.702 P=0.000 P=0.000 P=0.000 P=0.001

3 討 論

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞如嗜酸性細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及氣道上皮細(xì)胞等和細(xì)胞組分共同參與的氣道慢性炎癥性疾患。這些細(xì)胞相互作用，活化并分泌多種細(xì)胞因子導(dǎo)致黏膜上皮損傷、炎癥和氣道高反應(yīng)性。目前，在哮喘發(fā)病機(jī)制、病情估評及治療效果研究中，大量的研究針對氣道高反應(yīng)性的監(jiān)測，如峰流速監(jiān)測、氣道激發(fā)試驗和肺功能監(jiān)測。它們不能直接反映氣道炎癥的真實情況。以支氣管肺泡灌洗和支氣管黏膜活檢為代表的直接法，具有一定的危險性并受病情限制，不能作為常規(guī)臨床檢測手段。近年來，隨著痰液誘導(dǎo)方法的建立，痰液分析已廣泛應(yīng)用于哮喘氣道炎癥研究中，具有無創(chuàng)傷、不受病情限制的優(yōu)點(diǎn)，且痰液是來源于外周氣道至中央氣道的分泌物，具有更為集中的細(xì)胞和生化物質(zhì)成分，能夠反映氣道分泌物自然狀態(tài)下的濃度[3]。本研究通過對哮喘患兒血漿及誘導(dǎo)痰中IL-5、ECP、TNF-α、IL-8的對比觀察，顯示兩種標(biāo)本檢測結(jié)果具有正相關(guān)性，可作為監(jiān)測哮喘炎癥的生化指標(biāo)。但其誘導(dǎo)痰中的濃度明顯高于其外周血漿中的濃度。提示檢測誘導(dǎo)痰液炎性標(biāo)志物比檢測其血清標(biāo)志物更敏感、特異，且減輕患兒痛苦，更易被患兒及家長接受。

TNF-α主要由單核-巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，目前認(rèn)為[4]TNF-α是哮喘發(fā)作時氣道炎性反應(yīng)過程中的重要啟動因子，是氣道痙攣的強(qiáng)有力的刺激因子，可誘導(dǎo)炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子、受體和某些酶的基因表達(dá)，誘使單核一巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞聚集到損傷組織而被激活而釋放大量的TNF-α。

IL-5主要來源于活化的CD4T淋巴細(xì)胞（Th2）。IL-5近年來被認(rèn)為是調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞功能最重要的細(xì)胞因子，是嗜酸性粒細(xì)胞活化、成熟、趨化、存活和募集至氣道不可缺少的細(xì)胞因子[5,6]，也是使氣道炎癥持續(xù)存在的關(guān)鍵細(xì)胞因子[7]。

ECP為嗜酸性粒細(xì)胞活化后產(chǎn)生的毒性蛋白，ECP水平與被激活的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目有關(guān)，是嗜酸性粒細(xì)胞的激活標(biāo)志。嗜酸性粒細(xì)胞在氣道黏膜內(nèi)的聚集和激活能直接促發(fā)氣道炎性反應(yīng)。激活的嗜酸性粒細(xì)胞可表達(dá)各種細(xì)胞因子受體，釋放ECP等炎性介質(zhì)而發(fā)揮致炎作用。因此，ECP有可能成為臨床上反映哮喘氣道嗜酸粒細(xì)胞炎癥的客觀指標(biāo)。

IL-8是一種多功能的細(xì)胞因子，是由單核細(xì)胞／巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞等分泌，可作用于氣道內(nèi)各種炎癥細(xì)胞，在哮喘氣道炎癥形成中占有重要的地位。它可作為中性粒細(xì)胞趨化劑和誘導(dǎo)劑，也對嗜酸性粒細(xì)胞和T細(xì)胞有趨化作用，屬趨化性細(xì)胞因子的一員。IL一8趨化嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞在氣道黏膜積聚，可激活ECP及中性粒細(xì)胞，可使中性粒細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞脫顆粒，促其釋放花生四烯酸代謝產(chǎn)物前列腺素（PG）、白三烯B4（LTB4）等，引起支氣管平滑肌痙攣，導(dǎo)致遲發(fā)型哮喘。

隨著對支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，在如何評價氣道炎癥程度以指導(dǎo)哮喘的臨床防治方面，研究較為深入的是某些細(xì)胞因子、黏附分子和嗜酸性細(xì)胞顆粒相關(guān)蛋白等，但迄今尚未找到一種較為可靠的指標(biāo)。綜合IL-5、ECP、TNF-α、IL-8這4種炎性因子，既有較為穩(wěn)定的IL-5、TNF-α，又有較為特異敏感的ECP、IL-8，可以較為系統(tǒng)反映哮喘氣道炎癥的真實水平。

目前，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[8,9]血漿及誘導(dǎo)痰炎性因子具有相關(guān)性。本研究通過對血漿及誘導(dǎo)痰IL-5、ECP、TNF-α、IL-8進(jìn)行一系列研究與臨床觀察，發(fā)現(xiàn)二者具有正相關(guān)性。這將有助于進(jìn)一步闡明哮喘的病因，并為該病診療及轉(zhuǎn)歸的監(jiān)測提供新的理論根據(jù)和途徑。從而，痰液分析有可能成為一種實用而直接的非侵入性的監(jiān)測哮喘氣道炎癥的較好方法。

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