低氧運動干預(yù)對大鼠心肌細(xì)胞自噬作用的探討

陳福刁，林文弢，黃麗英

(1.韓山師范學(xué)院體育系，廣東潮州 521041;2.廣州體育學(xué)院運動生化教研室，廣東廣州 510500)

低氧運動干預(yù)對大鼠心肌細(xì)胞自噬作用的探討

陳福刁1，林文弢2，黃麗英2

(1.韓山師范學(xué)院體育系，廣東潮州 521041;2.廣州體育學(xué)院運動生化教研室，廣東廣州 510500)

目的:探討常壓低氧(13．6%氧含量)運動對大鼠心肌核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、Cyt c和自噬相關(guān)基因Beclin1的影響，為運動與低氧適應(yīng)機制的研究和高原訓(xùn)練方案的制定提供理論依據(jù)。方法:采用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)分別測大鼠心肌NF-κB、Cyt c和Beclin1的含量。結(jié)果:通過運動訓(xùn)練、低氧適應(yīng)或者是低氧運動適應(yīng)，都能使NF-κB和Beclin1不同程度升高，其中以HC和HiLo較為顯著，Cyt c變化不明顯，提示運動訓(xùn)練、低氧適應(yīng)或者低氧運動適應(yīng)都能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。結(jié)論:自噬相關(guān)基因Beclin1在低氧訓(xùn)練中產(chǎn)生的低氧適應(yīng)機制可能是低氧刺激后細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS，ROS激活了NF-κB信號通路，使得Beclinl與NF-κB活性增高;通過長期的運動與低氧適應(yīng)，可能ROS降低有效抑制NF-κB信號通路，使Beclinl和NF-κB產(chǎn)生了適應(yīng)性變化，Cyt c從線粒體釋放較少，提示細(xì)胞凋亡率減少，從而保護心肌細(xì)胞的作用。

低氧運動;自噬;Beclin1;核因子κB;Cyt c

作為一種細(xì)胞保護機制，自噬能降解和回收細(xì)胞器組分，受損線粒體能釋放促凋亡因子如細(xì)胞色素C(Cyt c)，故自噬可能阻斷凋亡。心肌富含線粒體，故自噬對心肌病理生理狀態(tài)具有重要意義，具有心肌保護作用。Beclin1不僅參與自噬體的形成，還可通過調(diào)節(jié)自噬活性對低氧適應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用。研究表明，低氧應(yīng)激后細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，激活了核因子κB(NF-κB)信號通路［1］，使Beclin1活性增高，可見低氧應(yīng)激與Beclin1密切相關(guān)［2］。Beclin1基因主要通過與PI3K形成復(fù)合體來調(diào)節(jié)其他的ATG蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中定位，調(diào)節(jié)自噬活性［3－4］。已經(jīng)證實通過上調(diào)Beclin1在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)能夠刺激自噬的發(fā)生［5］。自噬是細(xì)胞對內(nèi)外界環(huán)境壓力變化的一種反應(yīng)，在某些情況下自噬還可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，被認(rèn)為是區(qū)別于細(xì)胞凋亡(I程序性死亡)的另一種細(xì)胞程序性死亡形式(II型程序性死亡)［6］。為此探討低氧訓(xùn)練對大鼠心肌Beclin1、NF-κB和Cyt c的影響，從而了解低氧運動的干預(yù)對心肌細(xì)胞自噬的作用，為運動與低氧適應(yīng)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

六周齡雄性SD大鼠40只，體重160～180g，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲食，室溫23～25℃，濕度40%～60%，自然光照，自由飲食。飼養(yǎng)室、用具等定期消毒滅菌。所有大鼠在常氧條件下先進行一周跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練，使大鼠學(xué)會跑臺運動并適應(yīng)，強度從12m/min開始，遞增到18m/min，運動時間15min。

1.2 運動模型

40只大鼠隨機分為4組，每組10只，分別為低住安靜組(LC)、低住低練組(LoLo)、高住安靜組(HC)和高住低練組(HiLo)。實驗中使用的低氧發(fā)生設(shè)備為美國Hypoxico公司制造的低氧分壓系統(tǒng)。低氧組大鼠在該系統(tǒng)的低氧艙內(nèi)模擬低氧(常壓低氧:氧含量13.6%，模擬海拔高度3 500m)條件下生活、訓(xùn)練。使用自行研發(fā)的自動控制系統(tǒng)進行低氧環(huán)境的自動監(jiān)控。動物跑臺為杭州段氏大鼠跑臺。溫度維持在23～25℃，相對濕度40%～60%。常氧組大鼠在動物飼養(yǎng)室內(nèi)生活、訓(xùn)練。高住組每天12h在低氧下生活，低練組每天常氧下訓(xùn)練1h(每周4次)，跑速為35m/min，共4周。

1.3 實驗方法

各運動組在最后一次訓(xùn)練后24h取材，各相應(yīng)安靜組在同一時間進行取材。按0.3mL/100g體重劑量腹腔注射10%水合三氯乙醛溶液麻醉大鼠，迅速取出大鼠心臟，立即用液氮速凍，后保存于－80℃冰箱中。取心肌組織勻漿，在低溫高速離心機中以差速離心法分離細(xì)胞漿和線粒體，在酶標(biāo)儀上測定細(xì)胞漿Beclin1、NF-κB和 Cyt c。NF-κB、Beclin1和Cyt c ELISA kit試劑盒購自上海藍(lán)基生物科技有限公司。所有數(shù)據(jù)在SPSS13.0軟件上進行統(tǒng)計處理，采用獨立樣本T檢驗，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)來表示。

2 結(jié)果與分析

由表1可見，與低住安靜組比較，各組心肌細(xì)胞液體內(nèi)NF-κB都呈升高的趨勢，HC和HiLo組且有顯著性差異(P＜0.05);與低住低練組比較，HC和HiLo組NF-κB也相應(yīng)上升，且HC組有顯著性差異(P＜0.05)。與低住安靜組比較，各組心肌細(xì)胞液體內(nèi)Beclin1都呈升高的趨勢，且都有顯著性差異(P＜0.05);與低住低練組比較，HC和HiLo組Beclin1也都有上升現(xiàn)象，但不存在顯著性差異;與高住安靜組比較，HiLo組 Beclin1明顯升高，且存在顯著性差異(P＜0.05)。各組間心肌細(xì)胞液體內(nèi)Cyt c沒有顯著性差異。

表1 低氧和運動訓(xùn)練的干預(yù)大鼠心肌細(xì)胞液NF-κB、Beclin1和Cyt c的變化

3 討論

大量研究表明Beclin1不僅參與自噬體的形成，還可通過調(diào)節(jié)自噬活性對低氧適應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用。NF-κB是一個多效轉(zhuǎn)錄因子，由2個DNA結(jié)合亞基p50、p65組成異源二聚體，在胞質(zhì)中與抑制亞基IKBα結(jié)合，一旦接受激活信號，如氧化應(yīng)激、低氧等，IKBα被磷酸化并從復(fù)合物種解離，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。

3.1 低氧運動對核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的影響

NF-κB為一個轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，包括5個亞單位:Rel (cRel)、p65(RelA，NF-κB3)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)。最常見的NF-κB二聚體是p65與p50組成的異二聚體。NF-κB的抑制單位IκB通過其C末端特定的錨蛋白重復(fù)序列與NF-κB結(jié)合，并覆蓋NLS阻止NF-κB向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。在靜息的細(xì)胞中，NF-κB和IκB形成復(fù)合體，以無活性形式存在于胞漿中。當(dāng)細(xì)胞受細(xì)胞外信號刺激后，IκB激酶復(fù)合體(IκB kinase，IKK)活化將IκB磷酸化，使NF-κB暴露核定位位點。游離的NF-κB迅速移位到細(xì)胞核，與特異性κB序列結(jié)合，誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。NF-κB作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在體內(nèi)各組織細(xì)胞中廣泛存在，亦存在于心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)、血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)中，參與各種心血管疾病包括多種原因引起的心肌肥大的發(fā)生與發(fā)展。研究表明，低氧后細(xì)胞內(nèi)ROS水平、IκBα的Tyr磷酸化水平和細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的激活量均高［7］。缺氧信號激活Ras、Raf信號通路，活化NF-κB，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。IKBα酪氨酸羥基化被認(rèn)為是低氧/再氧合時的激活機制，長時間缺氧可激活I(lǐng)KBα的降解途徑，進一步強化對NF-κB的激活作用。本文實驗也觀察到運動訓(xùn)練能使大鼠心肌細(xì)胞NF-κB活性有所升高，但沒有顯著性差異，而低氧適應(yīng)或者是低氧運動適應(yīng)，能上調(diào)大鼠心肌細(xì)胞NF-κB活性，可能是運動和低氧兩種應(yīng)激都能激活Ras、Raf信號通路，從而啟動核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB;實驗同時發(fā)現(xiàn)高住低練組較高住安靜組NF-κB的活性要低，可能是通過長期的運動訓(xùn)練和低氧適應(yīng)后NF-κB產(chǎn)生了適應(yīng)，因而其活性有所下降，這是一種適應(yīng)性的表現(xiàn)。

3.2 低氧運動對自噬相關(guān)基因Beclin1的影響

自噬是由Ashford和Porter在1962年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有“自己吃自己”的現(xiàn)象后提出的，是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。自噬性溶酶體的作用底物是內(nèi)源性的，即來自細(xì)胞內(nèi)的衰老和崩解的細(xì)胞器或局部細(xì)胞質(zhì)等，它們由單層膜包圍，內(nèi)部常含有尚未分解的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基復(fù)合體或脂類、糖原等。自噬主要的生理功能是將胞質(zhì)中的大分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、RNA、過量儲存的糖原等)和一些細(xì)胞內(nèi)源性底物(包括由于生理或病理原因引起的衰老、破損的細(xì)胞器)在單位膜包裹的囊泡中大量降解，實現(xiàn)再循環(huán)，以維持細(xì)胞自身的穩(wěn)定。這個過程對于細(xì)胞成分更新、保持旺盛的生理狀態(tài)是至關(guān)重要的。運動能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，有氧運動通過上調(diào)自噬來介導(dǎo)心肌的保護作用［7－8］。本文實驗也觀察到運動訓(xùn)練自噬相關(guān)基因Beclin1含量升高，與文獻報道的基本一致。

Beclin1基因也稱BECN1基因，是酵母ATG6的同系物，也是哺乳動物參與自噬的特異性基因。與其他細(xì)胞器相比，自噬體的半衰期很短，只有8min左右，說明自噬是細(xì)胞對于環(huán)境變化的有效反應(yīng)。研究表明，低氧環(huán)境、缺血/再灌注刺激下產(chǎn)生氧化應(yīng)激，從而使Beclin1活性增高，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生［9－10］。Gurusamy［11］等報道缺血缺氧預(yù)適應(yīng)能增強自噬的發(fā)生，從而保護心臟細(xì)胞，實驗觀察到經(jīng)過低氧應(yīng)激適應(yīng)后，心肌細(xì)胞液體內(nèi)Beclin1活性增高，這與文獻報道相一致。Lum［12］等研究認(rèn)為，各種原因引起的細(xì)胞內(nèi)ATP水平的下降可以誘發(fā)自噬，從而保證細(xì)胞能量代謝的穩(wěn)定，利于細(xì)胞生存，低氧運動應(yīng)激心肌細(xì)胞ATP水平的下降，長期暴露在高原環(huán)境的人們，肌肉線粒體自噬發(fā)生［13］。Zhang［14］等研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)因子HIF-1誘導(dǎo)的BNIP3表達(dá)和Beclin-1與Atg5的組成性表達(dá)起著至關(guān)重要的作用，表明低氧也可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生線粒體自噬。在長期處于低氧環(huán)境的細(xì)胞中，線粒體自噬可以阻止細(xì)胞產(chǎn)生過多的ROS，從而抑制細(xì)胞死亡。實驗也發(fā)現(xiàn)低氧適應(yīng)和低氧運動適應(yīng)都能使自噬相關(guān)基因Beclin1不同程度升高，且低氧運動適應(yīng)比低氧適應(yīng)更能有效刺激自噬基因Beclin1的升高，且兩種應(yīng)激存在明顯的差異性。由此，推測低氧運動可能會發(fā)生細(xì)胞自噬，但其機制有待于進一步深入研究。

3.3 低氧運動對細(xì)胞色素C(Cyt c)的影響

正常情況下Cyt c位于線粒體膜間隙，結(jié)合線粒體內(nèi)膜且不能通過外膜。目前研究［15］認(rèn)為:Cyt c從線粒體釋放后，不僅使線粒體呼吸鏈電子傳遞受阻、細(xì)胞能量供應(yīng)減少，而且釋放到胞漿中Cyt c能與凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)和Caspase-9形成復(fù)合體，活化Caspase-3，從而激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Cyt c釋放后抑制ATP合成導(dǎo)致凋亡發(fā)生，這一過程發(fā)生在凋亡的晚期。Cyt c還具有抗氧化功能，因此推測其釋放入胞漿后，必然導(dǎo)致細(xì)胞ROS自由基水平上升，進而引起細(xì)胞凋亡。

康凱夫等［16］研究認(rèn)為Beclinl與NF-κB的關(guān)系密切，當(dāng)細(xì)胞受到各種因素(如低氧、缺血/再灌注、TNF2α、鈣超載、毒性化合物)刺激后，線粒體滲透性轉(zhuǎn)運通道(MTP)開放，線粒體腫脹，釋放Cyt c等凋亡因子。此時，細(xì)胞啟動自噬來清除受損線粒體，避免凋亡因子釋放進入胞質(zhì)，同時提高細(xì)胞對低氧的耐受力，對細(xì)胞起到一定保護作用，這些外界信號同時激活了NF-κB信號通路，使得Beclinl與NF-κB活性增高［17］，低氧環(huán)境ROS產(chǎn)生增加，低氧應(yīng)激MTP開放原因可能是ROS產(chǎn)生導(dǎo)致的。本文實驗發(fā)現(xiàn)高住低練組胞漿中Cyt c沒有明顯增加，而且較高住安靜組低，提示經(jīng)過低氧與運動適應(yīng)后，線粒體漏電減少，使ROS產(chǎn)生減少，因而只有少量的Cyt c釋放到細(xì)胞漿。

4 結(jié)論

1)運動能使心肌細(xì)胞自噬活性升高，自噬相關(guān)基因Beclin1增加。

2)低氧刺激后心肌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，ROS使IκB酪氨酸位點磷酸化，激活了NF-κB信號通路，從而使NF-κB活性升高。

3)自噬相關(guān)基因Beclin1在低氧訓(xùn)練中產(chǎn)生的低氧適應(yīng)機制可能是低氧刺激后細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS，ROS激活了NF-κB信號通路，使得Beclin l與NF-κB活性增高，線粒體滲透性轉(zhuǎn)運通道開放，線粒體腫脹，釋放到胞漿的Cyt c等凋亡因子增加;通過長期的運動與低氧適應(yīng)，可能ROS降低有效抑制NF-κB信號通路，釋放到胞漿的Cyt c等凋亡因子減少，使Beclin1和NF-κB產(chǎn)生了適應(yīng)性變化，從而保護心肌細(xì)胞的作用。

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Effects of Myocardial Cells in Rat of Autophagy by Hypoxia Training

CHEN Fudiao1，LIN Wentao2，HUANG Liying2
(1.P．E．Department，Hanshan Teacher’s College，Chaozhou 521041，Guangdong，China; 2.Sports Biochemical Faculty，Guangzhou Institute of Physical Education，Guangzhou 510500，Guangdong，China)

AIM:The effects of hypoxia training in atmosphere(concentration of oxygen is 13.6%)on the content of NF-κB，Cyt c and Beclin1，and the gene of autophagy were investigated，so that the theory of study on the mechanisms of hypoxic acclimatization and project of high altitude training is provided．Methods:the content of NF-κB，Cyt c and Beclin1 were assessed by ELISA．RESULTS:NF-κB and Beclin1 increased during training，hypoxic acclimatization and hypoxic training acclimatization，and HC and HiLo increased significantly．It showed that autophagy induced during training，hypoxic acclimatization and hypoxic training acclimatization．Conclusion:The mechanism in hypoxic acclimatization of the gene of autophagy Beclin1 may be:NF-κB and Beclin1 increase by ROS hypoxia-induced;NF-κB and Beclin1 developed acclimatization by NF-κB inhibited because of ROS decreasing，Cyt c didn’t increase，so that cardiocytes were protected．

Hypoxia training;Autophagy;Beclin1;Nuclear factor-kappa B;Cyt c

G804.7

A

1004－0560(2012)01－0070－03

2012-01-12;

2012-02-08

廣東省科技計劃項目(2010B060900113)。

陳福刁(1970－)，女，副教授，學(xué)士，主要研究方向為低氧預(yù)適應(yīng)與民俗體育學(xué)。

黃麗英(1971－)，女，教授，博士，主要研究方向為運動與低氧適應(yīng)，E－mail:huangliying@mail．tsinghua．edu．cn。

責(zé)任編輯:喬艷春

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