一種可同時(shí)檢測小腸推進(jìn)和吸收的方法

劉健翔，張昕曄，潘冬梅，張琴麗，李向榮

(浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310015)

推進(jìn)與吸收是小腸的兩個(gè)主要功能。目前常采用酚紅法、碳末法等來檢測小腸的推進(jìn)速度，其原理很簡單。D-木糖法則是評(píng)價(jià)腸道吸收情況的常用方法，它是基于D-木糖的特點(diǎn)，即體內(nèi)不產(chǎn)生，吸收后在肝臟不代謝，而以原型由腎臟排泄［1］。然而，在腸道定位給藥等研究中，經(jīng)常需要同時(shí)評(píng)價(jià)小腸的推進(jìn)速度和吸收情況，這時(shí)往往需要兩種模型兼用。如果能夠在一個(gè)動(dòng)物體同時(shí)進(jìn)行這兩項(xiàng)檢測，則可大大減少使用動(dòng)物的數(shù)量。本研究以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，探索一種胃飼含D-木糖和酚紅的混合試劑，以同時(shí)評(píng)價(jià)小腸吸收和推進(jìn)運(yùn)動(dòng)的簡便方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組情況 ICR 雄性小鼠60只，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，體重18～22 g，每組10 只。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d 后隨機(jī)進(jìn)行分組，分別為低、中、高劑量(1.25%、2.5%、5%)D-木糖+0.12%酚紅混合試劑組、5% D-木糖對(duì)照組、0.12%酚紅對(duì)照組、腸損對(duì)照組。其中，腸損對(duì)照組小鼠胃飼5%D-木糖高劑量+0.12%酚紅溶液。實(shí)驗(yàn)前12 h 禁食不禁水，胃飼容量為0.15 ml/10 g。

1.2 試劑 D-木糖(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，批號(hào):F20060404);酚紅(上海三愛思試劑公司);間苯三酚(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，批號(hào):F20060223);明膠(中國上海試劑總廠，批號(hào):20010620)。

1.3 儀器 Sp-754 型紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器公司);HH-4 型恒溫水浴鍋(江蘇億通分析儀器廠);TXL-2.5 型離心機(jī)(成都生科儀器公司)。

1.4 試劑準(zhǔn)備

1.4.1 低、中、高劑量混合試劑 稱取1.5 g明膠，加水7.5 ml，加入酚紅0.12 g，溶脹30 min，待溶脹完全后分別加入D-木糖0.125 g、0.25 g、0.5 g(分別為低、中、高劑量)，加水2.5 ml，60℃水浴溶解，混勻，37℃保溫。

1.4.2 5%D-木糖試劑 稱取1.5 g 明膠，加水7.5 ml，溶脹30 min 后加入D-木糖0.5 g，加水2.5 ml，60℃水浴溶解，37℃保溫。

1.4.3 0.12%酚紅試劑 稱取1.5 g 明膠，加水7.5 ml 溶脹30 min，取酚紅0.12 g，在溶脹過程中加入，溶脹完成后加水2.5 ml，60℃水浴，溶解，37℃保溫。

1.4.4 間苯三酚顯色劑 間苯三酚1 g，加冰醋酸200 ml，濃鹽酸12 ml，溶解混勻。

1.5 血中D-木糖濃度檢測 胃飼結(jié)束后10 min 時(shí)，小鼠眼眶取血0.4 ml，在3 000 r/min 離心40 min，取上清50μl，加水定容至10 ml，加入間苯三酚顯色劑5.0 ml，沸水浴加熱8 min，流水冷卻至室溫，放置10 min。高、中、低劑量組以酚紅對(duì)照試劑灌胃取血樣同時(shí)處理所得樣品為空白;D-木糖對(duì)照組以15%明膠試劑灌胃為空白，于554 nm 波長處測定吸光度。

1.6 小腸推進(jìn)率測定 脫頸椎處死小鼠，沿腹中線剪開腹腔，在腹腔內(nèi)找到酚紅在小腸內(nèi)推進(jìn)部位，用絲線結(jié)扎后分別于胃幽門處、盲腸下1 cm 處剪斷腸道，取出小腸直鋪在白紙上，分別測量胃幽門至結(jié)扎處距離(AD)和胃幽門至盲腸的小腸總長距離(OD)，以AD/OD 為小腸推進(jìn)率(%)。

1.7 D-木糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線 顯色劑:間苯三酚1 g，加冰醋酸200 ml，濃鹽酸12 ml，溶解混勻。稱取D-木糖0.3 g，溶解于10 ml 容量瓶中，分別取50μl、100μl、150μl、200μl、250μl、300μl 加水定容至10 ml，再分別取50μl 與試管中，加入顯色劑5.0 ml，沸水浴加熱8 min，流水冷卻至室溫，放置10 min。于554 nm 波長處測定吸光度。

1.8 腸損模型制備 采用快速缺血性夾閉方法制造腸損模型。缺血性夾閉方法:腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉。于腹正中線偏右處切開，切一大約0.5 cm×0.6 cm 切口，找到十二指腸，分離腸系膜上動(dòng)脈叢，用無損傷動(dòng)脈夾夾閉導(dǎo)致腸缺血，45 min 后松夾，縫合腹腔。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 13.0，所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)齊性采用單因素方差分析，組間差異顯著性進(jìn)行Student-t 檢驗(yàn)，P＜0.05 被認(rèn)為有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 間苯三酚法測定血中D-木糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線 見圖1。血中D-木糖在0.17 mg/ml～1.05 mg/ml 濃度范圍內(nèi)與554 nm 吸光度呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R 為0.9984。

圖1 D-木糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of D-xylose assay

2.2 胃飼混合試劑后血中D-木糖濃度 胃飼低、中、高劑量混合試劑(分別含1.25%、2.5%、5% D-木糖與0.12% 酚紅、15% 明膠)后，10 min 時(shí)低劑量組血中D-木糖濃度為(0.15±0.02)mg/ml，中 劑 量組 為(0.25±0.05)mg/ml，高劑量組為(0.47±0.06)mg/ml。由圖2 可見，隨著胃飼混合試劑中D-木糖濃度升高，血中D-木糖濃度相應(yīng)增高，在高劑量組顯著高于中劑量組。高劑量混合試劑組血中D-木糖濃度與5% D-木糖對(duì)照組［(0.45±0.04)mg/ml］無顯著差異(P ＞0.05)。高、中劑量混合試劑組血中D-木糖濃度分別極顯著(P＜0.01)和顯著(P＜0.05)高于腸損對(duì)照組［(0.12±0.03)mg/ml］。

2.3 D-木糖含量對(duì)小腸推進(jìn)率的影響 胃飼15 min 后，低、中、高劑量混合試劑組(分組同2.2)的小腸推進(jìn)率分別為(64.7±3.8)%、(72.7±7.3)%和(74.7±4.3)%，三組之間的小腸推進(jìn)率均無顯著差異(P ＞0.05)。中、低劑量混合試劑組的小腸推進(jìn)率與0.12%酚紅對(duì)照組［(59.0±5.4)%］無顯著差異。由圖3可見，隨著混合試劑中D-木糖濃度的遞增，小腸的酚紅推進(jìn)率有增加的趨勢(shì)，高劑量D-木糖組酚紅的小腸推進(jìn)率顯著(P＜0.05)高于酚紅對(duì)照組。在中、高劑量D-木糖組，小腸推進(jìn)率均顯著(P＜0.05)高于腸損對(duì)照組［(54.1±5.8)%］。

圖2 胃飼含不同劑量D-木糖的混合試劑10 min 后，血中D-木糖濃度Fig.2 Serum concentration of D-xylose at 10 min after i.g.administration of mixed reagent containing different doses of Dxylose

圖3 胃飼含不同劑量D-木糖的混合試劑15 min 后小腸的推進(jìn)率Fig.3 Small intestine propulsion rate at 15 min after i.g.administration of mixed reagent containing different doses of D-xylose

3 討論

本研究結(jié)合兩種常用的檢測方法，對(duì)同一只動(dòng)物胃飼混合試劑，再分別用D-木糖法檢測小腸吸收能力，用酚紅法檢測小腸推進(jìn)情況。該方法尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，小鼠胃飼酚紅和D-木糖的混合試劑15 min 后，酚紅在腸道內(nèi)的推進(jìn)率接近100%，方法學(xué)價(jià)值較低。為了減慢混合試劑的推進(jìn)速度，我們加入一定濃度的明膠，將整個(gè)混合檢測試劑制成較黏稠的混懸液。但是，明膠在溶脹濃度達(dá)到20% 時(shí)已經(jīng)完全飽和，整個(gè)明膠體系成為果凍狀的半固體，無法用以給小鼠定量灌胃。比較加入15%和10%明膠的效果發(fā)現(xiàn)，胃飼含10%明膠的混合試劑，在20 min 時(shí)推進(jìn)率接近90%，在25 min 時(shí)接近100%，即將進(jìn)入大腸;而胃飼含15%明膠的混合試劑，在20 min 時(shí)小腸推進(jìn)率約為75%，在25 min 時(shí)約為85%，比較符合觀察的需要。因此確定在混合試劑中加入15%的明膠，以控制推進(jìn)率。

胃飼給藥時(shí)，胃的擴(kuò)張刺激可能通過胃腸反射等影響小腸推進(jìn)率，因此給藥容量也是一個(gè)重要參數(shù)。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胃飼0.25 ml/10 g 的混合試劑后，小腸推進(jìn)率顯著高于胃飼0.15ml/10g 的小鼠，因此采用后者。另外，饑餓可使消化道蠕動(dòng)加快，為減少這一因素的影響，本實(shí)驗(yàn)要求對(duì)小鼠統(tǒng)一禁食不禁水12 h。此外，小腸蠕動(dòng)可能受到晝夜節(jié)律的影響，因此本實(shí)驗(yàn)各組在上午9 時(shí)同時(shí)開始胃飼。

為減少混合試劑中各種成分對(duì)檢測結(jié)果的可能影響，還需要確定其他參數(shù)。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)灌胃10 min、15 min 都可以在血中檢測到D-木糖。隨著吸收時(shí)間的增加，血液中D-木糖的濃度也增加，說明D-木糖在小腸內(nèi)的吸收十分迅速?？紤]到灌胃20 min 后小腸推進(jìn)率已近3/4，故選擇胃飼10 min 后即取血測定。

目前血液中D-木糖的檢測可采用HPLC法［2］，該法準(zhǔn)確可靠，但是對(duì)儀器設(shè)備等條件要求較高。本實(shí)驗(yàn)用間苯三酚為顯色劑，在554 nm 波長檢測D-木糖在血液中的濃度。由圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線可見，線性回歸相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9984?？梢?，間苯三酚法操作簡單、成本較低，而且檢測結(jié)果準(zhǔn)確，可以應(yīng)用。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，在沸水浴反應(yīng)4 min 后，葡萄糖、果糖、D-木糖等糖類，以間苯三酚為顯色劑，在554 nm 波長下有吸收［3］。D-木糖在554 nm 的吸收大大強(qiáng)于葡萄糖、果糖等，且有較好的分離度。由于在沸水中加熱4 min，間苯三酚與血中D-木糖的反應(yīng)不完全，吸收效果不佳。在延長沸水浴加熱時(shí)間后，D-木糖吸收有明顯增加，在8 min［4］左右D-木糖與顯色劑基本完全反應(yīng)，并且此時(shí)血中葡萄糖的吸收依然較低，不會(huì)對(duì)D-木糖吸收產(chǎn)生明顯影響。綜合考慮以上情況，本法最終選定沸水浴時(shí)間為8 min。

一般認(rèn)為酚紅在腸道內(nèi)不吸收，因而采用酚紅作為標(biāo)志用于判斷腸道推進(jìn)功能。但酚紅在混合試劑內(nèi)含量不能太高，否則試劑會(huì)由均勻的混懸液直接沉降析出，結(jié)成團(tuán)塊狀，這樣就無法定量給小鼠灌胃，不利于快速檢測。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)，0.12%的酚紅含量相對(duì)比較合適，整個(gè)混懸液能保持均一穩(wěn)定。該混和試劑在小腸內(nèi)推進(jìn)時(shí)，剖開腹腔可以很明顯分辨出酚紅推進(jìn)情況。但是，胡一橋等人［5］在對(duì)離子型藥物酚紅的研究中發(fā)現(xiàn)，酚紅在小腸內(nèi)實(shí)際上有少量吸收，血中因?yàn)榉蛹t的存在而有一定的吸光度。我們預(yù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，因此本研究設(shè)酚紅對(duì)照組，以此排除小腸內(nèi)酚紅吸收對(duì)結(jié)果帶來的可能影響。

從圖2 可見，胃飼混合試劑后，血中D-木糖濃度可以靈敏地反映小腸的吸收功能，而混合試劑中酚紅等其他成分并未影響D-木糖的吸收。從圖3 可見，D-木糖的加入可能增加了酚紅的小腸推進(jìn)率，這一現(xiàn)象需要進(jìn)一步研究。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可考慮適當(dāng)調(diào)低混合試劑中D-木糖的含量，以減少D-木糖對(duì)小腸推進(jìn)的影響，也可以增設(shè)相應(yīng)的對(duì)照組進(jìn)行比較。

從圖2 和圖3 還可看出，腸損對(duì)照組動(dòng)物的小腸吸收能力明顯低于對(duì)照，而腸損對(duì)小腸推進(jìn)的影響并不明顯，提示消化道缺血損傷主要影響小腸吸收功能。

綜上所述，采用含有0.12%酚紅、5%D-木糖和15%明膠的混合試劑，按0.15ml/10g 的容量胃飼小鼠，10 min 后取血用間苯三酚法測定D-木糖濃度，15 min 后取小腸測定酚紅推進(jìn)率，可快速、準(zhǔn)確地同時(shí)檢測小腸的吸收和推進(jìn)，成本低廉，結(jié)果可靠，便于應(yīng)用。兩種方法的合并可減少動(dòng)物用量和動(dòng)物個(gè)體差異，也為研究小腸推進(jìn)和吸收的關(guān)系提供了一種新模型。

［1］SHENG W，LI M(盛 惟，黎 明).The evaluation of xylose absorption experiment ［J］.Lishizhen Medicine and Materia Medica Research(時(shí)珍國醫(yī)國藥)，2001，12(2):112-113.(in Chinese)

［2］LIU F N，LUO N，TAN L(劉放南，羅楠，譚 力).The measurement of D-xylose normal range of blood and urine of healthy volunteers using HPLC after Dxylose absorption testing ［J］.Parenteral ＆Enteral Nutrition(腸外與腸內(nèi)營養(yǎng))，2004，11(3):184-186.(in Chinese)

［3］EBERTS T J，SAMPLE R H B，GLICK M R.A simplified，colorimetric micromethod for xylose in serum or urine，with phloroglucinol ［J］.Clin Chemistry，1979，25(8):1440-1443.

［4］LI J Y，SUN D(黎君友，孫 丹).Experimental study of gut absorptive capacity after trauma detected D-xylose content test with micromethod［J］.Chinese Journal of Clinical Rehabilitation(中國臨床康復(fù))，2003，20(8):2810-2811.(in Chinese)

［5］HU Y Q，ZHENG L Y，QIAN C Q(胡一橋，鄭粱元，錢陳欽).Absorption of phenol red from rat intestine［J］.Journal of China Pharmaceutical University(中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào))，1996，27(6):355-359.(in Chinese)