ES 細(xì)胞體外定向分化為睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞模型的建立

張瑩瑩，黃亞東，葛仁山，朱丹雁

(1.浙江大學(xué)藥學(xué)院 藥理毒理與生化藥學(xué)研究所，浙江 杭州 310058;2.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632;3.美國洛克菲勒大學(xué)，美國人口理事會，生物醫(yī)學(xué)研究中心，紐約 10065)

睪丸間質(zhì)細(xì)胞(leydig cells)是體內(nèi)合成分泌睪酮的主要細(xì)胞［1］，它分布于生精小管之間的疏松結(jié)締組織中，其含量占睪丸細(xì)胞數(shù)量的2%～4%。目前男性更年期綜合征，即中老年男子雄激素部分缺乏或中老年男性性腺功能減退是當(dāng)前普遍關(guān)注的社會問題。臨床主要應(yīng)用化學(xué)合成的雄性激素進(jìn)行替代治療，長期應(yīng)用易引起肝功能損害、高血脂癥及前列腺癌等并發(fā)癥。近年來國內(nèi)外專家嘗試開展了近親供體移植術(shù)或干細(xì)胞移植術(shù)治療睪丸損失或男性性腺低下癥，取得較好效果。但這種移植術(shù)存在供體來源有限、手術(shù)復(fù)雜、經(jīng)費高、受者需長期服用免疫抑制劑等缺點。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ES)在體外合適的培養(yǎng)條件下，可以定向分化為各種細(xì)胞類型，并可以替代器官中死亡或損傷的細(xì)胞恢復(fù)其正常功能。在男性生殖發(fā)育研究領(lǐng)域，對于睪丸間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育起源研究相對較少。尚未見由ES-D3細(xì)胞定向分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞及其影響分化發(fā)育機制相關(guān)報道，更未見利用該模型評價調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮功能為靶點促細(xì)胞分化劑的研究報道。

類固醇生成因子1(steroidogenic factor 1，SF-1)對生成類固醇酶的表達(dá)起重要調(diào)控作用，同時影響性腺發(fā)育過程。類固醇的生成需要SF-1 及其下游靶基因調(diào)節(jié)類固醇生成酶和膽固醇向激素轉(zhuǎn)化通路的調(diào)控［2-3］。在睪丸發(fā)育過程中，SF-1 調(diào)節(jié)StAR、P450scc 和3β-HSD1轉(zhuǎn)錄，活化CYP17A 啟動子［4-5］。已有文獻(xiàn)報道SF-1 在ES 細(xì)胞中是不表達(dá)的，但在ES-RW4細(xì)胞株中穩(wěn)定表達(dá)SF-1，是RA 和8Br-cAMP 誘導(dǎo)ES-RW4 分化時促進(jìn)類固醇生成所必需的［6］。

本實驗通過對小鼠ES-D3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染SF-1質(zhì)粒，同時采用RA 和8Br-cAMP 聯(lián)合誘導(dǎo)，建立ES 細(xì)胞體外定向分化為睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞(leydig-like cells)模型，有利于闡明睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞分化發(fā)育的相關(guān)機制，為進(jìn)一步研究以調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮功能為靶點的促細(xì)胞分化劑提供實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞系 小鼠ES-D3 細(xì)胞購買自美國ATCC 公司。

1.2 主要試劑 胎牛血清和高糖DMEM(Gibco 公司);非必需氨基酸(the non-essential amino acids，NEAA，美國Hyclone 公司);β-巰基乙醇(β-Me，Sigma 公司);重組小鼠白血病抑制因子(Leukaemia Inhibitory Factor，LIF，美 國Chemicon 公司);全反式維甲酸(Retinoic acid，RA)、8Br-cAMP (Sigma 公司);DMSO(Dimethylsulfoxid，Amerisco 公司);PCR 相關(guān)試劑(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);抗體3β-HSD1、P450scc、StAR(Abcam 公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔IgG 和抗鼠IgG(Santa Cruz公司);DyLight 488 標(biāo)記抗兔 IgG 和DyLight488 標(biāo)記抗鼠IgG(Santa Cruz 公司);DAPI(4，6-diamidino-2-phenylindole，Sigma 公司);轉(zhuǎn)染試劑Effectene Transfection Reagent(QIAGEN 公司);pIRES2-EGFP 及p-EGFP-SF1質(zhì)粒(英濰捷基貿(mào)易有限公司)。

1.3 主要儀器 超凈工作臺(Forma l851);CO2孵箱(Forma 3l11);離心機(Eppendoff 公司);熒光倒置顯微鏡(LEICA MPS 3O 型);蛋白質(zhì)電泳及電轉(zhuǎn)移裝置(北京六一儀器廠);PCR 儀(Eppendoff 公司);凝膠成像儀(Bio-Tek公司)。

2 方 法

2.1 SF-1 質(zhì)粒構(gòu)建 將SF-1 基因合成并構(gòu)建到pIRES2-EGFP 載體，對含有目的基因的pIRES2-EGFP 以及空載進(jìn)行大量抽提，最后得到含目的基因片斷的pIRES2-EGFP 載體質(zhì)粒和空載用于后續(xù)實驗。由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成?；蛐蛄腥缦?

2.2 小鼠ES 細(xì)胞轉(zhuǎn)染SF-1 質(zhì)粒并進(jìn)行誘導(dǎo)分化 用含10%胎牛血清、0.1%LIF 的高糖DMEM 將ES 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液(25 萬個/ml)，以每孔40 萬細(xì)胞量接種于6 孔板。每孔2μg 質(zhì)粒量按Effectene Transfection Reagent Handbook 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染組作對照。轉(zhuǎn)染24 h 后，去除上清液，加入含有10%胎牛血清的分化培養(yǎng)液，并加入RA 和8Br-cAMP，終濃度分別為5×10-7μmol/L 和1 mmol/L，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)48 h。

2.3 觀察ES 細(xì)胞SF-1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率及分化中細(xì)胞形態(tài)變化 對轉(zhuǎn)染SF-1 質(zhì)粒24 h 及分化48 h 后的ES 細(xì)胞進(jìn)行光鏡及熒光顯微鏡觀察，每個孔隨機取4個視野，分別在普通光及熒光下拍照，通過圖像分析統(tǒng)計每組顯示熒光的細(xì)胞數(shù)平均值，并計算轉(zhuǎn)染效率。拍照記錄分化中的細(xì)胞形態(tài)變化。

2.4 免疫熒光法檢測ES 細(xì)胞分化而來的細(xì)胞中P450scc 及3β-HSD1 表達(dá) 取ES 細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染并分化的樣本，用磷酸緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗兩遍，純冷甲醇固定15 min，再用含5%胎牛血清PBS/TritonX-100 處理1 h，然后分別加入一抗:①rabbit polyclonal anti-P450scc，1∶500 稀釋;②mouse monoclonal 3β-HSD1，1∶500 稀釋，4℃孵育過夜。第2天用PBS洗3遍，加入二抗:①DyLight 488 conjugated of rabbit anti-rabbit IgG，②DyLight 488 conjugated of goat anti-mouse IgG，1∶200 稀釋，37℃孵育1 h 后用PBS 清洗，DAPI 染色，用熒光顯微鏡觀察，拍照記錄。

2.5 RT-PCR 法檢測相關(guān)基因表達(dá)情況 分別收集轉(zhuǎn)染SF-1 24 h 后的ES 細(xì)胞及經(jīng)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞，按照Trizol reagent 說明書提取總mRNA，3μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄后PCR 擴增。引物序列見表1。PCR 產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，核酸染料代替物染色后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察及拍照分析。

表1 引物序列及PCR 反應(yīng)條件Table 1 Primers and conditions for reverse transcription-polymerase chain reaction

2.6 Western Blot 法檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 收集分化細(xì)胞樣本，4℃冰浴上加入裂解液(pH 7.5 20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1% Triton X-100，0.5% deoxysodium cholate，10 mmol/L PMSF，1μg/ml aprotinin，2 mg/ml leupeptin)，在冰上多次反復(fù)吹打30 min，4℃13 000×g 離心30 min 獲得上清即為總蛋白，Lowry 試劑盒法(DC 蛋白檢測試劑盒，Bio-Rad，CA，US)對蛋白濃度進(jìn)行定量，分裝后凍存?zhèn)溆谩DS-PAGE，蛋白免疫印記和膠片光密度分析方法按常規(guī)操作。SDS-PAGE 后將蛋白電轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗mouse monoclonal to StAR、rabbit polyclonal anti-P450scc、mouse monoclonal 3β-HSD1，1∶1 000 稀釋，加于5%脫脂奶中，4℃孵育過夜。洗膜3次，繼續(xù)孵育相應(yīng)二抗，1∶5 000 稀釋。相同條件下洗膜3次，用ECL 試劑顯色，暗室中用X 光膠片曝光。

3 結(jié)果

3.1 SF-1 轉(zhuǎn)染ES 細(xì)胞定向分化為睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞的形態(tài)變化 ES-D3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染帶有綠熒光蛋白的SF-1 質(zhì)粒24 h 后，熒光顯微鏡下即可見發(fā)綠色熒光的細(xì)胞。視野觀察轉(zhuǎn)染效率達(dá)30%～40%，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到基因轉(zhuǎn)染要求(圖1A)。RT-PCR 結(jié)果表明，未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的ES 細(xì)胞均無SF-1 基因表達(dá)，而轉(zhuǎn)染SF-1質(zhì)粒的ES 細(xì)胞表達(dá)SF-1 基因(圖1B)，提示SF-1 轉(zhuǎn)染成功并在ES 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。ES 細(xì)胞轉(zhuǎn)染SF-1 后加入RA 和8Br-cAMP 誘導(dǎo)分化48 h，出現(xiàn)較多胞體大而圓潤，長有觸角的紡錘形細(xì)胞，而其他對照組分化的細(xì)胞形態(tài)雜亂，沒有出現(xiàn)睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞形態(tài)(圖1C)。

圖1 SF-1 轉(zhuǎn)染ES 細(xì)胞的表達(dá)及分化形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 The expression and the apparent morphological changes of ES cells transfected with the plasmid SF-1

3.2 RT-PCR 和Western Blot 法檢測ES 細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞StAR、P450scc、3β-HSD1表達(dá) RT-PCR 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SF-1 的ES-D3 細(xì)胞在RA 和8Br-cAMP 誘導(dǎo)下分化而來的細(xì)胞，與對照組比較，StAR 表達(dá)增加，睪丸間質(zhì)細(xì)胞特異性基因P450scc 和3β-HSD1 出現(xiàn)顯著表達(dá)，但僅轉(zhuǎn)染SF-1 并無RA 和8Br-cAMP誘導(dǎo)時，StAR 表達(dá)不變，P450scc 和3β-HSD仍無表達(dá)(圖2A)。Western Blot 結(jié)果與PT-PCR 結(jié)果一致(圖2B)。結(jié)果提示，ES-D3細(xì)胞轉(zhuǎn)染SF-1 并在RA 和8Br-cAMP 誘導(dǎo)下，才能定向分化為睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞，僅轉(zhuǎn)染SF-1或僅以RA 和8Br-cAMP 誘導(dǎo)，并不能使ES-D3細(xì)胞向睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞分化。

3.3 免疫熒光法檢測ES 細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞中P450scc 和3β-HSD1 表達(dá) ES-D3細(xì)胞轉(zhuǎn)染SF-1 質(zhì)粒并經(jīng)RA 和8Br-cAMP 誘導(dǎo)分化48 h 后，分化而來的睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞中P450scc 和3β-HSD 有顯著表達(dá)，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組分化后的細(xì)胞中P450scc 和3β-HSD 均無表達(dá)。此結(jié)果進(jìn)一步證實轉(zhuǎn)染SF-1 的ES-D3 細(xì)胞能分化成睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞，明顯表達(dá)睪丸間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物蛋白(圖3)。

3 討論

目前，關(guān)于睪丸間質(zhì)細(xì)胞起源的相關(guān)研究報道較少，且主要由睪丸間質(zhì)干細(xì)胞分化，而由ES 細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的研究很少。ES細(xì)胞較睪丸間質(zhì)干細(xì)胞更容易獲得，其分化模型能模擬體內(nèi)復(fù)雜發(fā)育過程，富含大量生物信息，是高仿真胚胎發(fā)育體外研究的替代系統(tǒng)，有廣闊的應(yīng)用前景。Teerds 等報道［7］睪丸間質(zhì)干細(xì)胞在體外向睪丸間質(zhì)細(xì)胞分化過程中，3β-HSD陽性表達(dá)為睪丸間質(zhì)前體細(xì)胞的標(biāo)志，隨后出現(xiàn)P450scc、P45017α、LHR 蛋白表達(dá)［8］。

Crawford［6］等報道證明了小鼠ES-RW4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染SF-1 后，SF-1 的穩(wěn)定表達(dá)能改變ES 細(xì)胞形態(tài)，允許RA 和8Br-cAMP 誘導(dǎo)內(nèi)源性側(cè)鏈分裂酶基因的表達(dá)，最后促進(jìn)類固醇的生成。并且SF-1 發(fā)揮作用是通過其一定區(qū)域?qū)崿F(xiàn)的，若其DNA 結(jié)合域或AF2 轉(zhuǎn)率激活區(qū)被阻斷后，則不能發(fā)揮其正常功能。SF-1 不僅參與發(fā)育過程，而且對ES 細(xì)胞向生成類固醇的細(xì)胞分化啟動有非常重要作用。

本實驗采用ES-D3 細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染含SF-1 基因序列的質(zhì)粒，使SF-1 提前在ES 細(xì)胞中表達(dá)，同時在RA 和8Br-cAMP 誘導(dǎo)下，使ES 定向分化為睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞。結(jié)果表明，分化而來的睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞呈紡錘形，表達(dá)與類固醇生成有關(guān)特異性酶。進(jìn)一步驗證了SF-1 表達(dá)是ES細(xì)胞定向分化為睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞所必需的，RA和8Br-cAMP 能有效誘導(dǎo)表達(dá)SF-1 基因的ES細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞，而分化比率需進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)定量分析。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道［6-8］StAR、P450scc 和3β-HSD1 是睪酮合成過程中的重要蛋白，同時也是睪丸間質(zhì)前體細(xì)胞的標(biāo)志，因此，本實驗以StAR、P450scc 和3β-HSD1從無到有作為ES 定向分化為睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞成功的標(biāo)志，而睪酮分泌是睪丸間質(zhì)細(xì)胞的功能，亟待后續(xù)試驗中進(jìn)行。該分化模型的建立將有利于闡明睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞分化發(fā)育的相關(guān)機制，為進(jìn)一步評價調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞分泌睪酮功能為靶點的促細(xì)胞分化劑提供實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

［1］CHEN H，GE R S，ZIRKIN B R.Leydig cells:From stem cells to aging ［J］.Mol Cell Endocrinol，2009，306(1-2):9-16.

［2］PARKER K L，SCHIMMER B P.Transcriptional regulation of the adrenal steroidogenic enzymes［J］.Trends Endocrinol，1993，4(2):46-50.

［3］Richards J S.Hormonal control of gene expression in the ovary［J］.Endocr Rev，1994，15(6):725-751.

［4］GOLDMAN-JOHNSON D R，DE KRETSER D M，MORRISON J R.Evidence that Androgens Regulate Early Developmental ［J］.Endocrinology，2008，149(1):5-14.

［5］NAKAMOTO M，F(xiàn)UKASAWA M，TANAKA S，et al.Expression of 3b-hydroxysteroid dehydrogenase(hsd3b)，star and ad4bp/sf-1 during gonadal development in medaka (Oryzias latipes)［J］.Gen Com Endocrinol，2012，176(2):222-230.

［6］CRAWFORD P A，SADOVSKY Y，MILBRANDT J.Nuclear Receptor Steroidogenic Factor 1 Directs Embryonic Stem Cells toward the Steroidogenic Lineage［J］.Mol Cell Bio，1997，17(7):3997-4006.

［7］TEERDS K J，RIJNTJES E，VELDHUIZENTSOERKAN M B，et al.The development of rat Leydig cell progenitors in vitro:how essential is luteinising hormone［J］?J Endocrinology，2007，194(3):579-593.

［8］TANG H，BRENNAN J，KARL J，et al.Notch signaling maintains Leydig progenitor cells in the mouse testis ［J］.Development，2008，135(22):3745-3753.