β-聚蘋果酸高產(chǎn)菌株的篩選及鑒定

徐玲芬，陳忠華，趙 婧，阮 紅，劉森泉

(浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310015)

β-聚蘋果酸高產(chǎn)菌株的篩選及鑒定

徐玲芬，陳忠華，趙 婧，阮 紅，劉森泉

(浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310015)

目的：從自然界篩選β-聚蘋果酸(PMLA)高產(chǎn)菌株，并對其進行菌種鑒定。方法：從自然界取樣，經(jīng)過單菌落分離，根據(jù)菌落形態(tài)特征、聚蘋果酸的定性檢測和核酸序列分類鑒定手段，篩選PMLA高產(chǎn)菌株。結(jié)果：分離得到一株P(guān)MLA高產(chǎn)菌株，編號為Ⅱ04，經(jīng)形態(tài)學(xué)研究和ITS序列分析，確定為短梗霉菌Aureobasidium pullulans，命名為Aureobasidium pullulans ZUCC-41。該菌在25℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，采用高效液相色譜法(HPLC)進行產(chǎn)物定量分析，檢測到PMLA產(chǎn)量可達26．23 g/L。結(jié)論：從自然界中分離得到一株 PMLA高產(chǎn)菌株，經(jīng)鑒定為短梗霉菌Aureobasidium pullulans，其發(fā)酵產(chǎn)量可達 26．23 g/L。

蘋果酸鹽;有絲分裂孢子真菌/分離和提純;聚蘋果酸;高產(chǎn)菌株;鑒定

［J Zhejiang Univ(Medical Sci)，2012，41(4):434-440．］

聚蘋果酸(Poly-malic acid，PMLA)是一種可完全生物降解且擁有高度生物相容性的水溶性高分子聚酯，且降解產(chǎn)物無毒，具有新型環(huán)保包裝材料、醫(yī)用材料、化妝產(chǎn)品、藥物載體等巨大應(yīng)用前景［1］。聚蘋果酸有 α、β、γ等3種結(jié)構(gòu)，其中β-PMLA在自然界廣泛存在，用途也最為廣泛，微生物發(fā)酵所得均為β型［1］。蘋果酸和聚蘋果酸的結(jié)構(gòu)如圖1所示［2］。

圖1 蘋果酸與3種聚蘋果酸的結(jié)構(gòu)Fig．1 Structure of malic acid and poly(malic acid)s

聚蘋果酸的生產(chǎn)方法主要分為微生物發(fā)酵法與化學(xué)合成法，化學(xué)合成法多以β-烷氧羰基β-丙內(nèi)酯為單體，在引發(fā)劑的條件下，通過開環(huán)聚合得到，成本相對較高［3］。因此，人們尋求微生物發(fā)酵法開展聚蘋果酸合成及其規(guī)?；a(chǎn)。

Shimada等最早從圓弧青霉(Penicillium Cyclopium)中分離得到一種酸性大分子化合物，這種物質(zhì)有抑制蛋白酶的活性，推測可能是PMLA［4］。之 后 先 后 分 離 得 到 Physarum Polycephalum、 Aureobasidium Pullulans 和Aureobasidium Sp．等 PMLA產(chǎn)生菌。后來，對PMLA的研究多以這些菌種為研究對象［5-7］。篩選產(chǎn)酸能力強的發(fā)酵菌株及優(yōu)化培養(yǎng)條件是目前微生物發(fā)酵法制備PMLA急需解決的問題?，F(xiàn)在研究得比較多的是出芽短梗霉Aureobasidium系列，曾有文獻報道，Nagata等人在日本伊豆半島的某樹種樹皮上分離得到的出芽短梗霉A-91是一種聚蘋果酸高產(chǎn)菌［8］。國內(nèi)對于聚蘋果酸的研究較少。本研究從自然界微生物采集、分離和篩選，以期獲得產(chǎn)量較高的PMLA產(chǎn)生菌，并對其進行初步的分類鑒定，為今后β-聚蘋果酸的研究和開發(fā)提供新的菌種來源和實驗依據(jù)。

1材料與方法

1．1 材料

1．1．1樣本來源 樣本包括樹皮、樹葉和花及樹的分泌物，分別來自:湖州苗圃，編號為1～32;杭州植物園，編號為33～64;杭州高校，編

號為65～116，共計116個樣本。

1．1．2 主要試劑和儀器 新鮮馬鈴薯;試劑均為分析純。壓力蒸汽滅菌器(上海華儀醫(yī)用核子儀器生產(chǎn)有限公司);pH計(上海虹益儀器儀表有限公司);生化培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司);AllegraTM 64R centrifuge高速冷凍離心機(Beckman Coulter公司);DHZ-CA旋轉(zhuǎn)振蕩器(江蘇太倉華利達實驗設(shè)備公司);安捷倫 HPLC 1200高效液相色譜儀;生物顯微鏡BA 310(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)。

1．1．3 培養(yǎng)基 參見文獻［8］。富集培養(yǎng)基:10%甘露醇作為主要碳源，0．1%NH4NO3，0．05%KH2PO4，0．02%MgSO4·7H2O，0．2%檸檬酸、0．02%吐溫 80;分離培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板和斜面;篩選培養(yǎng)基:12% 葡萄糖，0．1%NH4NO3或 0．2%NaNO3作為氮源，0．01%KH2PO4，0．05%KCl，0．02%MgSO4·7H2O，3%CaCO3(單獨滅菌)，蒸餾水，分裝于250 ml三角瓶，每瓶含30 ml培養(yǎng)基(下同);種子培養(yǎng)基:8%葡萄糖，0．3%琥珀酸銨，0．2% 琥珀酸，0．04%K2CO3，0．01%KH2PO4，0．01%MgSO4·7H2O，5 ppm ZnSO4·7H2O，0．05%玉米渣液，2%CaCO3(單獨滅菌)，蒸餾水;基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:12%葡萄糖，0．3%琥珀酸銨，0．2% 琥 珀 酸，0．04%K2CO3，0．01%KH2PO4，0．01%MgSO4·7H2O，5 ppm ZnSO4·7H2O，0．05% 玉米渣液，3%CaCO3(單獨滅菌)，蒸餾水。

1．2 β-聚蘋果酸高產(chǎn)菌株的篩選

1．2．1 單菌落的分離 將樣品置于含有富集培養(yǎng)基的搖瓶培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)2～4 d，直至培養(yǎng)液中有渾濁出現(xiàn);將培養(yǎng)液搖勻，移取100 μl于分離培養(yǎng)基上涂布均勻，30℃培養(yǎng)2～4 d;定期觀察平板，依菌落生長情況進行菌種的多次分離純化直至形成單菌落為止。其中，若一個平板上生長有幾個菌落，則以A、B等加以區(qū)別，如1A 、1B。

1．2．2 采用篩選培養(yǎng)基進行初篩 挑取單菌落，接種于篩選培養(yǎng)基中，置搖床220 r/min 25℃培養(yǎng)7 d，發(fā)酵液用定性濾紙過濾，高速離心，取上清，稀釋后經(jīng)定性檢測有PMLA的作為初篩目的菌株。

1．2．3 采用發(fā)酵培養(yǎng)基進行復(fù)篩 從分離平板挑取初篩菌株的單菌落于PDA斜面上，培養(yǎng)至菌株單菌落生長旺盛(約2～3 d)，接種于種子培養(yǎng)基中，置搖床220 r/min 25℃培養(yǎng)2 d，再以5%的接種量在發(fā)酵培養(yǎng)基里以相同方法發(fā)酵培養(yǎng)7 d，發(fā)酵液離心，取上清，水解，高效液相色譜法測定PMLA產(chǎn)量，選取產(chǎn)量較高的菌株作為復(fù)篩目標菌株，并做進一步實驗。

1．3 發(fā)酵產(chǎn)物的分析方法

1．3．1 發(fā)酵液的前處理 復(fù)篩目標菌株的發(fā)酵液經(jīng)15 000 r/min離心20 min后，取上清液分兩份，其中一份加入等體積的0．5 mol/L H2SO4，90℃水解 9 h，用于后續(xù)的蘋果酸檢測［8］。

1．3．2 多糖含量的測定 采用硫酸-苯酚法。精確稱取無水葡萄糖0．05 g置50 ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，量取2．5 ml溶液置于50 ml容量瓶中，稀釋至刻度，制成貯液。分別量取 0．1、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0 ml加水稀釋至1．0 ml，再加5%苯酚溶液1 ml，迅速加入濃硫酸5 ml，搖勻，靜置室溫30 min，以空白為對照，在490 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖濃度C(mg/ml)為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制出標準曲線:y=9．7112x+0．0093(R2=0．9996)。取 1 ml發(fā)酵液，3 000 r/min離心2 min，取上清液0．5 ml并加入等體積乙醇，混勻，1 300 r/min離心5 min，蒸發(fā)殘余乙醇，加入0．5 ml水溶解沉淀，經(jīng)透析后測定其吸光度，由標準曲線回歸方程推算出發(fā)酵液中多糖含量。

1．3．3 聚蘋果酸的定性檢測 取水解前和水解后的發(fā)酵液，離心后各取5 ml于兩支試管中，分別滴入3滴15%TiC13溶液，幾分鐘后觀察是否有白色沉淀生成，并對比兩支試管的變化。將蘋果酸對照品溶液在優(yōu)化后的HPLC條件下進樣，確定蘋果酸在該條件下的保留時間，重復(fù)測定5次。蘋果酸的平均保留時間為6．655 min，RSD為0．44%。在樣品中加入蘋果酸標準液，根據(jù)峰高的突增來進一步驗證色譜峰的歸屬。

1．3．4 聚蘋果酸的定量測定 參照文獻［9］。精確稱取L-蘋果酸標準品，用蒸餾水分別配制成濃度為 0．125、0．25、0．5、1、2、3、4、5 g/L 的標準液，經(jīng)0．22 μm濾膜過濾后，采用優(yōu)化后的高效液相色譜法測定蘋果酸標準液，以L-蘋果酸濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標制作標準曲線 y=512．39x-3．3808(R2=1)。高效液相色譜條件:Agilent 1200 seires液相色譜系統(tǒng)，色譜柱 Synergi 4u Polar-RP(4．6 ×250 mm，5 μm);以 A(0．01 mol/L KH2PO4):B(乙婧)=95∶5為流動相，柱溫:30℃;紫外檢測波長:210 nm;進樣量:5 μl;檢測時間:15 min。水解前、后發(fā)酵液分別稀釋10倍和20倍，濾膜過濾，高效液相色譜法測定與蘋果酸標準品相同保留時間的峰面積，根據(jù)標準曲線求得水解前、后發(fā)酵液中蘋果酸含量，水解前后之差值即為PMLA含量。

1．4 菌種鑒定 按照生工SK1375真菌基因組DNA抽提試劑盒說明書，對細菌細胞總DNA進行提取，PCR擴增引物設(shè)計為:上游引物:5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3'(20 bp);下游引物:5'TCCTCCGCTTATTGATATGC 3'(19 bp)。50 μl反應(yīng)體系:模板 DNA 10 pmol/L、上游引物(10 μmol/L)1 μl、下游引物(10 μmol/L)1 μl、dNTPs混合液(10 mmol/L，each)1 μl、10 × Taq 反應(yīng)緩沖液 5 μl、Taq 酶(5 U/μl)0．25 μl，最后用無菌雙蒸水補足至 50 μl。擴增程序設(shè)定為:預(yù)變性98℃ 5 mim;循環(huán)95℃ 35 s，55℃ 35 s，72℃ 40 s;35 個循環(huán)后延伸8 min。PCR產(chǎn)物的純化:由PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果切割所需DNA目的條帶，用DNA凝膠純化試劑盒回收瓊脂糖凝膠上的PCR產(chǎn)物。測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。將測序結(jié)果送 GenBank庫 Blast分析［10］，在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索其同源性最高的序列，根據(jù)16SrRNA序列進化樹比對分析，最后確定菌種分類。

2結(jié)果

2．1 菌株初篩 在篩選培養(yǎng)基上經(jīng)過劃線分離共得到165個單菌落，并初篩到28株初篩菌株，菌株編號如表1所示。

表1 菌株初篩結(jié)果Table 1 The preliminary results of strains screening

2．2 復(fù)篩結(jié)果 初篩菌株采用產(chǎn)量較高的10株進行復(fù)篩，從結(jié)果(見表2)可以看出:編號為Ⅱ04的菌株產(chǎn)量最高，因此，后續(xù)研究均選用Ⅱ04菌株為研究對象。

表2 菌株復(fù)篩結(jié)果Table 2 The results of secondary screening

2．3 發(fā)酵產(chǎn)物的分析

2．3．1 苯酚-硫酸法測定發(fā)酵液中多糖含量菌株Ⅱ04發(fā)酵液經(jīng)測定多糖含量為15．61 g/L，證明加入的碳源除用于合成PMLA和自身代謝外還產(chǎn)生了一部分多糖。實驗中還發(fā)現(xiàn)，當發(fā)酵液中加入等體積乙醇后產(chǎn)生的多糖沉淀能纏繞于玻棒，初步斷定產(chǎn)生的多糖中含有普魯蘭多糖等成分。

2．3．2 紫外-可見分光光度儀分析 根據(jù)紫外-可見分光光度法光譜掃描結(jié)果圖可看出:蘋果酸標準品和Ⅱ04菌株發(fā)酵產(chǎn)物的光譜圖基本相似(圖2)，可以初步判斷發(fā)酵液水解產(chǎn)物中含有蘋果酸。

2．3．3 HPLC定量分析 對聚蘋果酸發(fā)酵液水解前后HPLC的定性檢測，結(jié)果顯示水解前的發(fā)酵液無明顯的白色沉淀生成，水解后有明顯的白色沉淀生成。蘋果酸的平均保留時間為6．525 min，RSD 為 0．44%，樣品目的峰與標準品出峰時間一致，標準品圖譜見圖3。在樣品中加入蘋果酸標準液，在原目的峰的基礎(chǔ)上峰面積變大，表明目的峰對應(yīng)的是蘋果酸，水解液HPLC圖譜見圖4。

2．4 菌種分類鑒定

2．4．1 形態(tài)特征 菌株Ⅱ04在分離平板上菌落最初呈白色，外表有光澤，但是隨著培養(yǎng)的進行逐漸變成粉白色，然后逐漸變綠變暗，最后變成黑色(圖5)。其菌體細胞在顯微鏡下觀察呈卵圓形，酵母樣，著色均勻(圖6)。

圖2 蘋果酸標準品(左)和菌株Ⅱ04發(fā)酵產(chǎn)物水解液(右)的光譜圖Fig．2 Spectrograms of standard malic acid(left)and hydrolytic products from fermentation broth(right)

圖3 蘋果酸標準品的HPLC圖譜Fig．3 HPLC map of malic acid standard

圖4 發(fā)酵液水解后HPLC含量測定圖譜Fig．4 HPLC map of hydrolyzates from fermentation broth

圖5 菌株Ⅱ04平板劃線圖Fig．5 Streak plating of strain Ⅱ04

2．4．2 菌株Ⅱ04的ITS序列分析 提取菌株Ⅱ04的基因組DNA，經(jīng)PCR擴增后回收測序，所測菌株Ⅱ04的ITS核苷酸序列長度為 519 bp。送 GenBank庫，根 據(jù)GenBank Blast分析提供的基因序列，依據(jù)16SrRNA序列構(gòu)建進化樹進行比對分析，其中同源性最高的菌株是Aureobasidium pullulans，同 源 性 為100%，再結(jié)合其菌落形態(tài)及16SrRNA序列分析的系統(tǒng)進化結(jié)果，菌株Ⅱ04初步鑒定為 Aureobasidium pullulans，命名為Aureobasidium pullulans ZUCC-41(圖7)。

3討論

圖6 菌株Ⅱ04的細胞形態(tài)顯微圖(40×)Fig．6 Micrograph of strainⅡ04(40×)

許多微生物能合成聚羥基烷基酯類，作為其碳源和能量的儲存形式。聚蘋果酸作為聚羥基二元酸酯的一種，是近來發(fā)現(xiàn)的一類生物聚酯，到目前為止，只在少數(shù)真菌中發(fā)現(xiàn)有聚蘋果酸產(chǎn)物［11］。本研究從樹皮、樹葉和樹的分泌物及花中篩選得到28株聚蘋果酸產(chǎn)生菌，再經(jīng)過復(fù)篩得到聚蘋果酸的高產(chǎn)菌株04。其發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜定量分析，產(chǎn)量可高達26．23 g/L，高于國內(nèi)報道15．15 g/L 的發(fā)酵產(chǎn)量［12］。

圖7 基于菌株Ⅱ04的16SrDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．7 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of strain Ⅱ04

依據(jù)菌株Ⅱ04的形態(tài)以及ITS基因序列分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)它屬于出芽短梗霉菌，初步鑒定為 Aureobasidium pullulans。出芽短梗霉屬是屬于一類與酵母親緣關(guān)系密切的真菌，多存在于植物材料上及土壤中，經(jīng)常能和酵母一起分離得到。由于遺傳的不穩(wěn)定性，它們往往易形成很多變種，菌落最初粘稠，白色，很快轉(zhuǎn)變?yōu)榈G色，最終變?yōu)楹谏?，與Ⅱ04菌落特征相似。據(jù)報道出芽短梗霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多聚糖多種多樣，其中最為重要的有普魯蘭多糖，它是一種細胞外水溶性的中性多糖［13］。本研究在對菌株Ⅱ04的發(fā)酵液進行乙醇沉淀時，發(fā)現(xiàn)有類似普魯蘭多糖，測得發(fā)酵液的多糖含量為15．61 g/L。

考慮到胞外多糖的產(chǎn)量會影響聚蘋果酸的產(chǎn)量，我們分離得到的菌株中糖量較少，性能較穩(wěn)定，易于培養(yǎng)，產(chǎn)生的黑色素少，比較利于聚蘋果酸的產(chǎn)生［14］。此外，我們將在PMLA高產(chǎn)菌篩選工作的基礎(chǔ)上，進一步開展PMLA高產(chǎn)菌發(fā)酵條件的優(yōu)化研究，為今后蘋果酸生產(chǎn)工業(yè)化提供實驗數(shù)據(jù)與理論指導(dǎo)。

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［責(zé)任編輯 張榮連］

Screening and identification of high-yield poly(β-malic acid)bacterial strain

XU Ling-fen，CHENG Zhong-hua，ZHAO Jing ，RUAN Hong，LIU Sen-quan(School of Medicine and Life Science，Zhejiang University City College，Hangzhou 310015，China)

Objective:To isolate and identify the high-yield poly-malic acid(PMLA)bacterial strains from the nature．Methods:Samples were collected and cultured．The high-yield PMLA bacterial strains were screened through morphological observation，qualitative PMLA tests by HPLC and ITS sequence analysis on the isolated bacterial strains．Results:A high-yield PMLA strainⅡ04 was isolated，the yield of PMLA of the strain reached to 26．23g/L in the rotary shaker at 25℃ for 7d．From morphological observation and ITS sequences analysis，the strain belonged to Aureobasidium pullulans，and named as Aureobasidium pullulans ZUCC-41．Conclusion:A high-yield bacterial strain has been isolated from the nature and identified to be Aureobasidium pullulans．

Malates;Mitosporic fungi/isol;Poly(malic acid);High-Producing Strain;Identification

Q 939．9

A

1008-9292(2012)04-0434-07

2011-04-08

2011-11-21

2010年浙江省大學(xué)生新苗人才計劃資助項目;杭州市科技局重點實驗室科技創(chuàng)新資助項目(20080432T05)．作者簡介：徐玲芬(1989-)，女，本科生，主要從事微生物發(fā)酵研究．

阮紅(1968-)，女，博士，教授，主要從事天然產(chǎn)物生物活性研究;E-mail:ruanhong@zucc．edu．cn

10．3785/j．issn．1008-9292．2012．04．013