河北道地藥材板藍(lán)根HPLC指紋圖譜研究

孟巖 范麗芳 張?zhí)m桐 賈聚坤 王巧

板藍(lán)根(Radix isatidis)為我國傳統(tǒng)中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》?！吨袊幍洹?2010版一部)規(guī)定為十字花科植物菘藍(lán)(Isatis indigotica Fort．)的干燥根，性寒味苦，具有清熱解毒、涼血利咽之功效，用于溫疫時(shí)毒，發(fā)熱咽痛，溫毒發(fā)斑、痄腮、爛喉丹痧、大頭瘟疫、丹毒、癰腫等癥［1］。主要化學(xué)成分為有機(jī)酸類、氨基酸、生物堿類化合物?！冬F(xiàn)代中醫(yī)藥大辭典》有記載:河北為板藍(lán)根主要產(chǎn)區(qū)之一。本文對來自不同產(chǎn)地的20批板藍(lán)根樣品進(jìn)行了水溶性和脂溶性的HPLC-UV指紋圖譜分析，以10批河北產(chǎn)道地藥材生成對照指紋圖譜，并與不同產(chǎn)地的板藍(lán)根藥材指紋圖譜進(jìn)行相似度比較，以確定板藍(lán)根藥材的質(zhì)量。該方法重復(fù)性和精密度良好，有助于板藍(lán)根藥材的標(biāo)準(zhǔn)化種植與道地藥材的質(zhì)量控制，同時(shí)為該藥材的鑒別提供新的依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters 1525高效液相色譜儀，Waters 2487紫外檢測器，Empower工作站;SCQ-200超聲波清洗器(100 W，25 kHz)(上海聲譜超聲波設(shè)備廠)。乙腈為色譜純(迪馬公司)，水為二次蒸餾水，其他溶劑均為分析純。靛藍(lán)對照品(批號(hào):110716-200206)、靛玉紅對照品(批號(hào):717-200204)和板藍(lán)根對照藥材(批號(hào):121177-200302)均由中國藥品生物制品檢定所提供。本研究收集了20批不同產(chǎn)地的板藍(lán)根(Radix isatidis)樣品(經(jīng)生藥學(xué)鑒定)，見表1。晾干，切成小段，置烘箱內(nèi)，于40℃烘干8 h，取出，用粉碎機(jī)粉碎，過3號(hào)篩，置干燥器中，備用。

表1 板藍(lán)根藥材樣品來源

2 方法與結(jié)果

2．1 溶液的制備

2．1．1 靛藍(lán)對照品儲(chǔ)備液:取靛藍(lán)對照品適量，精密稱定，至25 ml量瓶中，加氯仿溶解并稀釋制成1 ml中含0．10 mg的溶液，精密吸取1．0 ml，置10 ml量瓶中，加氯仿溶解并定容，即得。

2．1．2 靛玉紅對照品儲(chǔ)備液:取靛玉紅對照品適量，精密稱定，置25 ml量瓶中，加氯仿溶解并稀釋制成1 ml中含0．15 mg的溶液，精密吸取1．0 ml，置10 ml量瓶中，加氯仿溶解并定容，即得。

2．1．3 水溶性部分樣品溶液:取藥材粉末0．25 g，精密稱定，置10 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，稱定重量，超聲提取20 min，取出，放冷，用水補(bǔ)足重量，搖勻，取上清液，用微孔濾膜(0．45 μm)濾過，即得。

2．1．4 脂溶性部分樣品溶液:取藥材粉末2．0 g，精密稱定，置50 ml圓底燒瓶中，精密加入25 ml氯仿，稱重。于70℃恒溫回流5 h，取出，放冷，用氯仿補(bǔ)足重量，搖勻，濾過，濾液蒸干，定容至 1 ml，微孔濾膜(0．45 μm)濾過，即得。

2．2 水溶性部分指紋圖譜的建立

2．2．1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn):色譜柱為DiamonsilTM C18 柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)(迪馬公司);甲醇-水為流動(dòng)相，洗脫程序見表2;檢測波長為260 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 μl，所有色譜峰均達(dá)到基線分離。且在45 min內(nèi)檢測完成，見圖1。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

圖1 道地板藍(lán)根藥材水溶性部分指紋圖譜及共有峰標(biāo)識(shí)

2．2．2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取3號(hào)板藍(lán)根藥材粉末，精密稱定，按2．

1．3 項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8，10，12，24 h 檢測指紋圖譜。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版軟件計(jì)算相似度，結(jié)果均大于0．9;各主要色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積比值無明顯變化，其RSD值分別為0．11% ～1．5%和0．17% ～2．3%，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．2．3 精密度試驗(yàn):制備3號(hào)樣品的供試品溶液1份，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜，相似度均大于0．9;各主要色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積比值的RSD值分別為0．09% ～1．8%和0．15% ～2．5%，說明精密度良好。

2．2．4 重復(fù)性試驗(yàn):平行制備3號(hào)樣品的供試品溶液6份，分別進(jìn)樣，記錄指紋圖譜，相似度均大于0．9;各主要色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積比值的RSD值分別為0．17% ～2．1%和0．29% ～2．9%，說明重復(fù)性良好。

2．2．5 水溶性部分的指紋圖譜:取河北產(chǎn)板藍(lán)根藥材(1～10號(hào)樣品)，按2．1．3項(xiàng)下制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC分析，得到道地板藍(lán)根藥材水溶性部分的指紋圖譜及其10個(gè)共有峰，見圖1;10批道地藥材指紋圖譜及生成的對照圖譜(R)，見圖2;計(jì)算其相似度，見表3。

2．2．6 不同產(chǎn)地藥材水溶性部分的指紋圖譜:取不同來源的板藍(lán)根藥材(11～20號(hào)樣品)，按2．1．3項(xiàng)下制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC分析，得到10批不同來源板藍(lán)根藥材的指紋圖譜，見圖3;并計(jì)算其與對照指紋圖譜比較的相似度，見表3。

圖2 10批道地藥材水溶性部分指紋圖譜及生成的共有模式(R)(S1～S10:樣品1～10 R:對照指紋圖譜)

圖3 不同產(chǎn)地板藍(lán)根藥材水溶性部分指紋圖譜(S1～S10:樣品11～20 R:對照指紋圖譜)

表3 板藍(lán)根藥材水溶性部分指紋圖譜與對照指紋圖譜比較的相似度

2．2．7 結(jié)果分析:由表3可知，所收集20批板藍(lán)根藥材，其水溶性部分的成分基本一致，只是各峰峰面積稍有不同。板藍(lán)根有大葉和小葉之分，其中小葉板藍(lán)根為市售常用品。結(jié)果顯示，大葉板藍(lán)根水溶性部分與小葉板藍(lán)根組分相同，相似度較高，與小葉板藍(lán)根沒有區(qū)別。因此，初步認(rèn)定在以水溶性部分為藥用部位時(shí)，大葉板藍(lán)根可與小葉板藍(lán)根混用。同時(shí)，其他產(chǎn)地與河北產(chǎn)板藍(lán)根藥材成分也一致，相似度無顯著性差異。因此，初步認(rèn)定在以水溶性部分為藥用部位時(shí)，其它產(chǎn)地板藍(lán)根均可替代河北產(chǎn)板藍(lán)根使用。建議板藍(lán)根水溶性部分指紋圖譜相似度在0．850～1．000可統(tǒng)一使用。

2．3 脂溶性部分指紋圖譜的建立

2．3．1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn):色譜柱為 DiamonsilTM C18 柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);乙腈 － 0．05% 磷酸為流動(dòng)相，洗脫程序見表4;檢測波長為300 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 μl。理論板數(shù)按靛藍(lán)、靛玉紅的色譜峰計(jì)算分別為8 300、12 000，分離度均大于1．5，且在115 min內(nèi)檢測完成。見圖4。

表4 流動(dòng)相梯度洗脫程序

圖4 道地板藍(lán)根藥材脂溶性部分指紋圖譜及共有峰標(biāo)識(shí)(9:靛藍(lán);10:靛玉紅)

2．3．2 穩(wěn)定性試驗(yàn):取1號(hào)板藍(lán)根藥材粉末，精密稱定，按2．1．4 項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8，10，12，24 h 檢測指紋圖譜。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版軟件計(jì)算相似度，結(jié)果均大于0．9;各主要色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積比值無明顯變化，其RSD分別為0．19% ～1．95%和0．31% ～2．37%，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．3．3 精密度試驗(yàn):制備1號(hào)樣品的供試品溶液1份，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜，相似度均大于0．9;各主要色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積比值的RSD值分別為0．25% ～1．99%和0．58% ～2．90%，說明精密度良好。

2．3．4 重復(fù)性試驗(yàn):平行制備1號(hào)樣品的供試品溶液6份，分別進(jìn)樣，記錄指紋圖譜，相似度均大于0．9;各主要色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積比值的RSD值分別為0．22% ～2．11%和0．76% ～2．95%，說明重復(fù)性良好。

2．3．5 脂溶性部分的指紋圖譜:取河北產(chǎn)板藍(lán)根藥材(1～10號(hào)樣品)，按2．1．4項(xiàng)下制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC分析，得到道地藥材的指紋圖譜及其14個(gè)共有峰，見圖4;10批道地藥材指紋圖譜及生成的對照圖譜(R)，見圖5;計(jì)算其相似度，結(jié)果見表5。

2．3．6 不同產(chǎn)地藥材脂溶性部分的指紋圖譜:取不同來源的板藍(lán)根藥材(11～20號(hào)樣品)，按2．1．4項(xiàng)下制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC分析，得到10批不同來源板藍(lán)根藥材的指紋圖譜，見圖6;計(jì)算其與對照指紋圖譜比較的相似度，結(jié)果見表5。

2．3．7 結(jié)果分析:板藍(lán)根脂溶性成分比較復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)以峰面積較大的峰進(jìn)行積分比較。10批河北產(chǎn)小葉板藍(lán)根藥材的化學(xué)成分基本一致，但各成分含量高低有一定差別，靛藍(lán)、靛玉紅含量普遍較高，相似度也較高。而其他產(chǎn)地板藍(lán)根(包括河北武安大葉板藍(lán)根)均有成分缺失現(xiàn)象，且靛藍(lán)、靛玉紅含量較低。因此，以板藍(lán)根脂溶性為藥用部位時(shí)，一定要固定產(chǎn)地。目前甘肅產(chǎn)板藍(lán)根充斥著藥材市場，由表7可知，其相似度也較高;據(jù)圖6所示，甘肅板藍(lán)根靛藍(lán)靛玉紅含量相對較高。因此初步認(rèn)定板藍(lán)根脂溶性部分為藥用部位時(shí)，甘肅板藍(lán)根可以代替河北產(chǎn)板藍(lán)根使用，并建議板藍(lán)根脂溶性部分指紋圖譜相似度在0．850以上。

圖5 10批道地藥材脂溶性部分指紋圖譜及生成的共有模式(R)(S1～S10:樣品1～10 R:對照指紋圖譜)

圖6 不同產(chǎn)地板藍(lán)根藥材脂溶性部分指紋圖譜(S1～S10:樣品11～20 R:對照指紋圖譜)

表5 板藍(lán)根藥材脂溶性部分指紋圖譜與共有模式比較的相似度

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-UV法，對來自不同產(chǎn)地的20批板藍(lán)根樣品的水溶性部分和脂溶性部分分別進(jìn)行了指紋圖譜分析，利用相似度軟件以10批道地板藍(lán)根指紋圖譜生成對照指紋圖譜，并對不同產(chǎn)地間藥材的差異進(jìn)行了研究。建立了河北道地藥材板藍(lán)根水溶性部分和脂溶性部分的對照指紋圖譜，有助于板藍(lán)根藥材的質(zhì)量控制及規(guī)范化種植，同時(shí)為板藍(lán)根的鑒別提供新的依據(jù)。

迄今為止，尚無公認(rèn)能反應(yīng)板藍(lán)根內(nèi)在質(zhì)量的指標(biāo)成分用于控制其藥材及制劑的質(zhì)量［2］?，F(xiàn)行藥典對板藍(lán)根的品質(zhì)評(píng)價(jià)和控制是以精氨酸為指標(biāo)，既不是特異性成分(不能鑒別真?zhèn)?，也不是有效成分(不能體現(xiàn)療效好壞)，因此無法評(píng)價(jià)板藍(lán)根藥材的品質(zhì)。在這種情況下，通過多種活性成分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)而進(jìn)行質(zhì)量控制顯得較為客觀實(shí)際。因此，這種可實(shí)現(xiàn)多組分、多指標(biāo)分析，能反映中藥材及其提取物以及其成品中全面的、多層次整體信息的指紋圖譜是實(shí)現(xiàn)板藍(lán)根藥材及其制劑質(zhì)量控制的最佳方法。

現(xiàn)有文獻(xiàn)對不同產(chǎn)地板藍(lán)根的水溶性或乙酸乙酯提取物進(jìn)行指紋圖譜研究，考慮板藍(lán)根的化學(xué)成分和藥理活性，本實(shí)驗(yàn)對水溶性和氯仿提取物兩部分進(jìn)行了檢測［3－5］。板藍(lán)根的藥理作用之一為抗病毒，綜合現(xiàn)有的研究成果表明，與板藍(lán)根抗病毒作用相關(guān)的成分主要集中在大極性部位，這與板藍(lán)根臨床應(yīng)用多以水提物為主相符，也符合板藍(lán)根的傳統(tǒng)用藥方式，本實(shí)驗(yàn)采用水提法對樣品進(jìn)行處理。同時(shí)有實(shí)驗(yàn)證明氯仿提取物為板藍(lán)根抗內(nèi)毒素活性最強(qiáng)部位，靛藍(lán)、靛玉紅是其主要活性成份，且靛玉紅是治療慢性粒細(xì)胞白血病的有效成份之一［6］。因此，經(jīng)實(shí)驗(yàn)篩選采用氯仿回流對板藍(lán)根藥材進(jìn)行提取，作為脂溶性部分的樣品溶液。從研究結(jié)果可以看出，所收集板藍(lán)根樣品水溶性部分均無明顯差異，但脂溶性部分則差異較大。因此，板藍(lán)根單一做水溶性或脂溶性某一部分的指紋圖譜均不能完全反應(yīng)板藍(lán)根的內(nèi)在質(zhì)量。中藥不同有效部位的藥理作用不同，可根據(jù)不同的臨床應(yīng)用對中藥進(jìn)行選擇。如傳統(tǒng)用藥如水煎劑、水提醇沉入藥、或進(jìn)行極性較大部分的實(shí)驗(yàn)研究，則以上部分地區(qū)所產(chǎn)板藍(lán)根均無明顯差別，可統(tǒng)一用藥。而以脂溶性部分用藥或進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，則宜使用道地藥材。

本研究水溶性部分比較了不同提取時(shí)間的提取效果，確定超聲20 min，各色譜峰的響應(yīng)值不再增加，且方法穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。脂溶性部分比較了回流、索氏提取、超聲提取等不同提取方法的提取效果，并比較了酸水提取、氨水堿化后提取、氯仿直接提取的方法，同時(shí)還考察了不同提取時(shí)間的提取效果。結(jié)果表明，以氯仿為提取溶劑，回流5 h時(shí)，各色譜峰的響應(yīng)值不再增加，且方法穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。波長選擇為以HPLC-DAD分析，得到三維全波長紫外掃描圖，根據(jù)圖譜選擇各成分紫外吸收均較強(qiáng)，分離度較好的波長進(jìn)行檢測。

1 國家藥典委員會(huì)主編．中國藥典(一部)．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010．191．

2 雷黎明，潘清平．板藍(lán)根化學(xué)、藥理、質(zhì)量及提取方法的研究進(jìn)展．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18:2578．

3 馬莉，孫琴，李友，等．HPLC法測定板藍(lán)根藥材及制劑中靛藍(lán)和靛玉紅含量．藥物分析雜志，2010，30:1644．

4 趙艷玲，曹琳，王伽伯，等．板藍(lán)根水提物的HPLC指紋圖譜．中草藥，2005，36:1819．

5 林文艷，莫建霞，于榮敏，等．板藍(lán)根藥材HPLC指紋圖譜研究．中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2005，22:378．

6 劉云海，方建國，謝委．板藍(lán)根抗內(nèi)毒素機(jī)制研究．中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，34:442．