不同生境及地區(qū)哈蟆油藥材中氨基酸成分比較分析△

王殿波，陳斌，單舒筠，李峰

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

中藥科技

不同生境及地區(qū)哈蟆油藥材中氨基酸成分比較分析△

王殿波，陳斌，單舒筠，李峰*

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

目的：比較不同生境及地區(qū)的哈蟆油藥材中氨基酸的含量，為評(píng)價(jià)該藥材質(zhì)量提供依據(jù)。方法：6 mol·L－1鹽酸110℃水解24 h，加衍生化試劑2，4-二硝基氟苯，于60℃水浴中衍生1 h，P230II依利特氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。結(jié)果：同一地區(qū)林下產(chǎn)的哈蟆油藥材中氨基酸含量，普遍高于稻田產(chǎn)的；相同生境中，林下產(chǎn)哈蟆油藥材以吉林產(chǎn)的氨基酸最高；稻田產(chǎn)哈蟆油藥材以遼寧產(chǎn)的最高。結(jié)論：以哈蟆油藥材中氨基酸的含量對(duì)其藥材質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，具有一定的實(shí)際意義。

哈蟆油；氨基酸；不同生境及地區(qū)；含量比較

哈蟆油RANAE OVIDUCTUS為蛙科動(dòng)物中國(guó)林蛙Rana temporaria chensinensisDavid雌蛙的輸卵管。性平，味甘、咸；歸肺、腎經(jīng)。具補(bǔ)腎益精，養(yǎng)陰潤(rùn)肺功效。用于病后體弱，神疲乏力，心悸失眠，盜汗，癆嗽咳血［1］。首載于 《藥材資料匯編》［2］。目前哈蟆油商品藥材主要為東北地區(qū)林下和稻田兩種生境中的人工養(yǎng)殖的。本實(shí)驗(yàn)收集東北地區(qū)兩種生境下的26份哈蟆油商品藥材，對(duì)其中具有補(bǔ)益作用的氨基酸成分的種類與含量進(jìn)行測(cè)定及比較分析，以期為哈蟆油藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

P230II依利特氨基酸自動(dòng)分析儀；UV230II紫外檢測(cè)器（大連依利特公司）；AS5150A超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PHS-25型pH計(jì)（上海盛磁儀器有限公司）；AR2140電子分析天平（METTLE公司）。

1.2 試藥與材料

1.2.1 對(duì)照品 ELITE-AAK氨基酸對(duì)照品（18種氨基酸）。

1.2.2 試劑 衍生化試劑為2，4-二硝基氟苯（由大連依利特公司提供）。乙腈為色譜純；冰醋酸，N，N-二甲基酰胺為分析純；水為純凈水。

1.2.3 材料 哈蟆油商品藥材于2010年6月購(gòu)于各產(chǎn)地，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定均為正品，具體生境及產(chǎn)地見(jiàn)表1。

表1 哈蟆油商品藥材生境與產(chǎn)地

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為依利特公司氨基酸分析專用ODS柱，柱溫：27℃；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；流動(dòng)相總流速1.2 mL·min－1，梯度洗脫，流動(dòng)相梯度曲線見(jiàn)表2。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫曲線

2.2 流動(dòng)相的配制

流動(dòng)相a為乙腈－水（1∶1）；流動(dòng)相b為流動(dòng)相固體組分B 4.1 g加水950 mL，用冰醋酸調(diào)pH至6.4～6.8，加10mLN，N-二甲基酰胺，置1 000mL量瓶，以水定容，搖勻，備用。

2.3 衍生緩沖溶液的配制

稱取衍生緩沖溶液固體組分A 1.24 g，固體組分B 7.063 g，置500 mL量瓶中，以水定容，搖勻，備用。

2.4 平衡緩沖溶液的配制

稱取平衡緩沖溶液固體組分A 0.91 g，固體組分B 3.58 g，置250 mL量瓶中，以水定容，搖勻，備用。

2.5 對(duì)照品溶液的制備

取ELITE-AAK氨基酸對(duì)照品適量，精密稱取，用衍生緩沖溶液定容置250 mL容量瓶中，混勻，備用。

2.6 供試品溶液的制備

稱取表1中各樣品粉末適量（過(guò)40目篩，每份約80 mg），精密稱定，置具塞試管中，再加入3 mL 6 mol·L－1鹽酸，混勻，放入烘箱中110℃水解24 h。將水解后樣品從具塞試管轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿中，多次用水洗滌，洗液一并轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿中，80℃水浴蒸干。以衍生緩沖溶液多次洗滌蒸發(fā)皿，洗液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，并用衍生緩沖溶液定容，混勻，以0.45μm微孔濾膜過(guò)濾。取已過(guò)濾的樣品液5 mL置25 mL棕色容量瓶中，加衍生化試劑5 mL，混勻，于60℃水浴中，暗處反應(yīng)1 h，反應(yīng)完畢，取出冷卻至室溫，加平衡緩沖溶液定容，混勻，以0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密量取2.5項(xiàng)下的對(duì)照品溶液5，10，15，20μL，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，以各氨基酸對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)X，其相應(yīng)的峰面積值為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各氨基酸成分的回歸方程及線性范圍見(jiàn)表3。

表3 各氨基酸的回歸方程及線性范圍

2.8 方法學(xué)考察

2.8.1 精密度試驗(yàn) 取3＃供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次測(cè)定，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的 RSD≤0.53%、相對(duì)峰面積的 RSD≤2.8%，表明儀器精密度良好。

2.8.2 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取3＃樣品5份粉末適量（過(guò)40目篩，每份約80 mg），精密稱定，按2.6項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD≤0.62%、相對(duì)峰面積的RSD≤2.9%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.8.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取3＃供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，于2、4、8、10、24 h進(jìn)樣測(cè)定，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD≤0.49%、相對(duì)峰面積的RSD≤2.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8.4 加樣回收率試驗(yàn) 分別取已知含量的3＃樣品5份粉末適量（過(guò)40目篩，每份約40 mg），精密稱定，并分別精密加入2.5項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按2.6項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率的RSD≤1.67%。

2.9 含量測(cè)定

分別精密量取各供試品溶液10μL，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，分別測(cè)定各供試品溶液的18種氨基酸的色譜峰峰面積，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算各氨基酸的含量見(jiàn)表4、5。

表4 林下產(chǎn)哈蟆油商品藥材中氨基酸種類及含量/%

表5 稻田產(chǎn)哈蟆油商品藥材中氨基酸種類及含量/%

3 小結(jié)與討論

由表4、5可見(jiàn)，26份產(chǎn)于東北地區(qū)林下與稻田的哈蟆油藥材中，均含所檢測(cè)的18種氨基酸，其中包括8種人體必需氨基酸（與已有文獻(xiàn)報(bào)道的一致［3-5］）；且各種樣品中氨基酸的含量均存在一定差異，因此，檢測(cè)哈蟆油藥材中氨基酸的含量，對(duì)于控制哈蟆油商品藥材質(zhì)量具有一定意義。

分別比較表4、表5中，同一生境下不同地區(qū)的哈蟆油藥材中氨基酸含量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，林下產(chǎn)哈蟆油藥材中，以吉林的必需氨基酸含量最高，總氨基酸含量以遼寧的最高，兩者均以吉林的含量最低；稻田產(chǎn)哈蟆油藥材中，必需氨基酸與總氨基酸含量，均以遼寧的含量最高，以黑龍江的含量最低；這可能哈蟆油藥材傳統(tǒng)主產(chǎn)區(qū)及該動(dòng)物自然分布有關(guān)。

將表4與表5數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)同一地區(qū)的兩種生境所產(chǎn)哈蟆油藥材氨基酸含量（氨基酸總量均值及必需氨基酸總量均值）均是林下產(chǎn)的高于稻田產(chǎn)的。這與目前藥材市場(chǎng)上認(rèn)為林下產(chǎn)哈蟆油藥材質(zhì)量較好相一致。

有關(guān)哈蟆油藥材中氨基酸種類及含量分析已有報(bào)道，姜大成等［5］對(duì)不同地域產(chǎn)哈蟆油中氨基酸的含量進(jìn)行了測(cè)定，曲婷婷［6］對(duì)黑龍江中部地區(qū)林蛙油氨基酸含量進(jìn)行了測(cè)定分析。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定哈蟆油藥材中氨基酸含量較以上報(bào)道中哈蟆油藥材中氨基酸含量稍低，這與樣品處理方法、測(cè)定條件、樣品采集時(shí)間、樣品生境及地區(qū)不同有關(guān)。

有關(guān)氨基酸組分分析方法，有氨基酸自動(dòng)分析儀分析法［5-8］、高效液相色譜法及毛細(xì)管電泳法［9］，本實(shí)驗(yàn)采用的是氨基酸自動(dòng)分析儀分析法。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典［S］.一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：239.

［2］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.下冊(cè).上海：上海人民出版社，1977：1651.

［3］王紅燕，徐綏緒.哈蟆油化學(xué)成分與藥理研究概況［J］.中成藥，1998，20（9）：39.

［4］李成義，李運(yùn)春，葉漢光.中國(guó)林蛙中氨基酸含量的研究［J］.白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1991，1（4）：351-353.

［5］姜大成，肖井雷.名貴中藥哈蟆油質(zhì)量評(píng)價(jià)的初步研究［J］.吉林中醫(yī)藥，2010，30（5）：429-431.

［6］曲婷婷.黑龍江省中部地區(qū)中國(guó)林蛙油營(yíng)養(yǎng)成分的比較［D］.東北林業(yè)大學(xué)，2005：16，19-21.

［7］劉繼紅，尚娟，賈斌，等.蜈蚣、全蝎、地龍氨基酸含量測(cè)定［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2005，40（3）：483.

［8］李澤鴻，姚玉霞，等.二杠鹿茸與三杈鹿茸中氨基酸含量的比較［J］.氮基酸和生物資源，2003，25（1）：10-11.

［9］賈薇，陳濤，李進(jìn).中藥中氨基酸含量測(cè)定的研究概況［J］.天津藥學(xué)，2009，21（5）：50-52.

Comparative and Analysis the Composition of Amino Acids in Ranae Oviductus Medicinal Materials in Two Kinds of Habitat and Different Areas

WANG Dian-bo，LIFeng，ZHANG Zhen-qiu
（Liaoning University of traditional Chinese Medicine，Dalian116600）

Objective：Compare the content of amino acids in Ranae Oviductus medicinal materials in two kinds of habitat，provides the basis for evaluating the quality of the medicinal materials.Methods：Hydrolysis in 6 moL·L－1hydrochloric acid in 110℃ for 24 h，add derivative of reagent 2，4-2 nitro fluorine benzene，in 60℃water derivative 1 h，P230IIYiLiTe amino acids automatic analyzer analysis.Results：The content of amino acids in Ranae Oviductus medicinal materials in the same area，in the forests are higher than in the rice fields in common；in the same habitat，in the forest of jilin is the highest，in the rice field of Liaoning is the highest.Conclusion：The contents of amino acid in Ranae Oviductus medicinal materials for quality evaluation is feasible.

Ranae Oviductus；Amino acids；Two kinds of habitat and different areas；Content comparison

2011-10-31）

國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目（30973881），沈陽(yáng)市科技局資助項(xiàng)目（1081238-1-00）

*［通訊作者］李峰，E-mail：zhanglijiayi＠163.com