受磷蛋白磷酸化位點Ser16在大鼠心力衰竭中的作用及機制

陳開祥,周新華,秦愛建

(1.江蘇省連云港市第二人民醫(yī)院急診中心,江蘇連云港,222000;2.揚州大學江蘇省動物預防醫(yī)學重點實驗室,江蘇揚州,225003)

心力衰竭是各種心臟疾病的終末階段,研究心力衰竭的發(fā)生機制對該病的防治極其重要。心肌舒縮功能與肌漿網(wǎng)鈣泵(SERCA2a)的活性密切相關,SERCA2a活性主要由受磷蛋白(PLB)調控,PLB是心臟心肌收縮和β-腎上腺素能激活的基本調節(jié)蛋白[1]。本實驗通過建立異丙腎上腺素誘導心力衰竭大鼠模型,觀察心力衰竭大鼠肌漿網(wǎng)PLB基因和蛋白表達與磷酸化的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取6周齡S-D大鼠80只,雌雄不拘,體質量140～160 g,購置揚州大學醫(yī)學院實驗動物比較中心。

1.2 主要實驗試劑與器材

H-89(美國CALBIOCHEM 公司);異丙腎上腺素(美國Sigma公司);[γ-32P]ATP(北京福瑞生物工程公司);Phospholamban小鼠抗大鼠單克隆抗體(美國ABR公司);HRP標記的山羊抗小鼠抗體(美國Sigma公司);HRP標記的抗大鼠GAPDH抗體(上?？党缮锛夹g有限公司);ECL檢測試劑盒(美國Pierce公司);Medlab生物信號采集系統(tǒng)(南京美易生物技術有限公司)。

1.3 心衰模型的制備[2]

造模組40只大鼠給予異丙腎上腺素2 mg/(kg·d)皮下注射,共4周,實驗過程中死亡4只,存活36只。對照組(40只)給予0.9%生理鹽水0.5 mL皮下注射。制模期間嚴格掌握給藥量和給藥時間,注意觀察動物活動、全身狀態(tài)和攝食情況。

1.4 實驗動物分組和給藥

造模4周后用導管法檢測大鼠血流動力學。予直徑約0.5 mm的硬塑管至左心室,連接八導電生理記錄儀觀察記錄心率、左心室壓力曲線,包括左心室舒張末壓(LVEDP)和左心室收縮壓(LVSP),推算左心室壓力最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室壓力最大下降速率(-dp/dtmax)。將造模成功的36只心衰大鼠和40只正常大鼠分別隨機分H-89陰性亞組和陽性亞組。各組大鼠在相同條件下飼養(yǎng),分組后大鼠分別進行如下處理:①H-89陽性亞組:按0.05 mg/(kg·d)予 H-89(3 μ mol/L)灌胃[3],1 d/次;②H-89陰性亞組:予等體積的二甲亞砜(DMSO)灌胃,1 d/次,共給藥8周。

1.5 血流動力學測定和左心室重量指數(shù)(LVMI)測定

給藥8周后如上方法再檢測 LVSP及LVEDP,估算+dp/dtmax和-dp/dtmax。大鼠麻醉后稱重,斷頭猝死立即取出心臟,剪取左心室和室間隔組織,濾紙吸干水分,稱重,計算左室(含室間隔)與體質量比值,以mg/g表示。

1.6 PLBmRNA表達的檢測

PLB:Forward:5′-AAGTCCAATACCT TAC TCGCTCGG-3′;Reverse:5′-TCACAGTAGCATCACAATGATGCAG-3′;β-actin:Forward:5′-AGCCATGTACGTAGCCATCCAG-3′;Reverse:5′-CGGTCAGGATCT TCATGAGGTAGT-3′,用Trizol法提取心肌組織總RNA。用AMV二步法進行反轉錄聚合酶鏈反應。反轉錄條件:42℃反轉錄1 h;PCR條件:95℃預變性5 min,94℃變性30s,72℃延伸30s,行28個循環(huán)擴增,再以72℃延伸8 min。電泳、凝膠成像,軟件分析。并以PLB擴增帶的平均灰度值分別與βaction擴增帶的平均灰度值的比值表示PLB基因的表達量。

1.7 PLB蛋白表達的檢測

先制備心肌肌漿網(wǎng)勻漿。將大鼠處死后取心室組織,充分研磨。將勻漿離心,收集上清再離心,上清再離心(20 kg,60 min,4℃),最后將獲得的沉淀物(即肌漿網(wǎng)粗提物)用重懸液[成分(mmol/L):組氨酸 30、蔗糖 0.25、EDTA 10 和NaF 10,pH7.4]重懸。用Bradford法測定蛋白質濃度。

再各取20 μg變性總蛋白進行SDS-PAGE凝膠(15%)電泳,轉膜,封閉抗原,與小鼠抗大鼠的單克隆PLB抗體(購自美國ABR公司,1:500稀釋)雜交,洗膜并與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠的抗體(購至美國SIGMA公司,1∶5000稀釋)和HRP標記的抗大鼠的GAPDH抗體(購至上海康成生物技術有限公司,1∶5000稀釋)共同孵育。顯色,曝光、顯影、定影,軟件分析。并以PLB的平均灰度值與相應PAGDH的平均灰度值的比值表示PLB蛋白的表達量。

1.8 PLB磷酸化水平的檢測

各取30 μg總蛋白置入 30 μL的反應液中,并迅速加入釩酸鈉、焦磷酸鈉、5.6 μL PKA 催化亞單位(H-89干預組同時再加入50 μ mol/L的H-8910 μL),37 ℃預孵育 5 min。加入 30 μ Ci[r-32P]ATP啟動磷酸化反應,37℃5 min,加入SDS上樣緩沖液終止磷酸化反應,再進行SDSPAGE凝膠(12%)電泳,染色、脫色、烘膠,曝光、顯影、定影。軟件分析計算條帶的平均灰度值。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件分析處理,實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示,采用卡方檢驗。P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 對照組與造模組血流動力學參數(shù)和左室指數(shù)的檢測和計算

與對照組比較,造模組的心肌收縮功能明顯下降(P<0.05),左室指數(shù)顯著增大(P<0.05)。結果見表1。

表1 對照組與造模組血流動力學參數(shù)和左室指數(shù)的比較()

表1 對照組與造模組血流動力學參數(shù)和左室指數(shù)的比較()

＊P<0.05。

分組 n LVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg/s)-dp/dtmax(mmHg/s)LVM I(mg/g)對照組 20 66.21±4.3 1.09±0.11 2608.4±40.8 -2620.8±35.8 0.353±0.03造模組 60 49.46±2.2＊ 2.83±0.36＊ 1806.6±38.4＊ -1789.3±39.0＊ 0.438±0.02＊

2.2 各實驗組血流動力學參數(shù)和左室指數(shù)的檢測和計算

前胡丙素組較心力衰竭組左室收縮功能明顯改善(P<0.05),心臟左室指數(shù)明顯降低(P<0.05);同時H-89亞組與相應的實驗組比較,左室收縮功能增強(P<0.05),左室指數(shù)亦降低(P<0.05,唯有正常組2亞組 P>0.05)。如下表2。

表2 各實驗組血流動力學參數(shù)和左室指數(shù)的比較()

表2 各實驗組血流動力學參數(shù)和左室指數(shù)的比較()

與相應的對照組比較,△P<0.05,+H-89亞組與相應的組比較,＊P<0.05。

分組 n LVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg/s)-dp/dtmax(mmHg/s)LVM I(mg/g)對照組 10 69.31±4.9 1.17±0.14 2537.1±48.7 -2672.7±38.2 0.372±0.03+H-89亞組 10 57.52±4.7＊ 1.02±0.17＊ 2128.6±41.2＊ -2122.7±40.3＊ 0.387±0.04心衰組 12 49.65±2.2■ 3.03±0.38■ 1863.3±40.9■ -1895.2±37.4■ 0.440±0.05＊+H-89亞組 12 40.37±4.2＊ 2.21±0.31＊ 1724.1±34.5＊ 1735.0±35.7＊ 0.490±0.05＊

2.3 各組PLBmRNA表達量結果

與對照組比較,心力衰竭組PLBmRNA表達量明顯升高(P<0.01),同時各H-89亞組較相應的實驗組比較,PLBmRNA表達量均顯著下降(P<0.01),見圖1。

圖1 各組PLBmRNA表達水平的比較

2.4 各組PLB蛋白表達量結果

與對照組比較,心力衰竭組蛋白表達量明顯升高(P<0.01),同時各H-89亞組較相應的實驗組比較,PLB蛋白表達量均顯著下降(P<0.01),見圖2。

圖2 各組PLB蛋白表達水平的比較

2.5 各組PLB蛋白磷酸化水平檢測結果

與對照組比較,心力衰竭組PLB蛋白磷酸化水平明顯下降(P<0.01),同時各H-89亞組較相應的實驗組比較,PLB蛋白磷酸化水平均顯著下降(P<0.01),見圖3。

圖3 各組PLB磷酸化水平的比較

3 討 論

心力衰竭是各種心臟病的終末期表現(xiàn),眾多研究已知心力衰竭與許多神經(jīng)體液因子異常有關,但其具體發(fā)生的分子機制較復雜,目前并非十分明確,可能涉及各種離子通道、信號轉導及能量產(chǎn)生等方面,其中心肌細胞內鈣調節(jié)失衡尤為重要。肌漿網(wǎng)將Ca2+釋放到細胞質而引起心肌細胞收縮;再通過SERCA2a將Ca2+泵回到肌漿網(wǎng)而實現(xiàn)心肌細胞舒張。迄今為止PLB被認為是肌漿網(wǎng)中調控SERCA2a的活性的唯一磷酸化底物。有研究顯示SERCA2a活性減弱與心力衰竭的發(fā)生密切相關[4]。

作者在以往的實驗中發(fā)現(xiàn)大鼠心肌細胞缺氧-復氧后PLB磷酸化水平顯著下降,同時基因和蛋白表達水平亦明顯下降[5]。本課題發(fā)現(xiàn)心力衰竭大鼠左室明顯肥厚,而且收縮功能減弱,受磷蛋白基因表達和蛋白表達水平明顯升高,可能與PLB在心力衰竭發(fā)展過程中長時間抑制SERCA2a的活性,心肌肌漿網(wǎng)調控Ca2+異常,致心肌收縮功能受損。同時心力衰竭大鼠PLB磷酸化水平下降,亦致使肌漿網(wǎng)SERCA2a轉運鈣離子能力下降,終出現(xiàn)心肌收縮功能不全。有學者[6]用基因轉導或轉基因技術證實未磷酸化的PLB能抑制SERCA2a的功能,減弱心肌收縮和舒張功能,在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。在超表達PLB的轉基因大鼠中,發(fā)現(xiàn)SERCA2a攝取Ca2+功能受抑制,心肌收縮功能受損,心室重塑、間質纖維化、胎兒基因轉錄和心肌肥厚,最終導致擴張型心肌病、心力衰竭[7]。在PLB缺陷小鼠中SERCA2a對Ca2+親和力增強,心肌舒縮功能增強,而心率未發(fā)生變化,這進一步說明PLB在調節(jié)心臟功能方面起著重要作用[8]。本實驗同上述亦證實了PLB在心力衰竭的發(fā)展過程中至關重要,可能通過調控肌漿網(wǎng)SERCA2a的活性終導致心肌舒縮功能障礙。

PLB的磷酸化則由不同的激酶和磷酸酯酶所調控。迄今為止已知PLB有3個磷酸化位點,分別為絲氨酸-16(Ser16),蘇氨酸-17(Thr17)和蘇氨酸-10(Thr10),其中Ser16可被cAMP依賴的蛋白激酶A(PKA)磷酸化。在β-腎上腺素能激動過程中,Ser16是主要磷酸化位點,并能調控完整的β-腎上腺素能效應;Thr17的磷酸化可能僅發(fā)生在胞質Ca2+濃度充分升高之后,即β-腎上腺素能激動達到最高水平時。cAMPPKA通路是心肌細胞發(fā)揮生理性能重要的神經(jīng)激素信號傳導通路。心肌β1-腎上腺素受體(β1-AR)激活,觸發(fā)cAMP依賴的激酶活化,使心肌細胞PKA活性持久增強,促使PLB磷酸化,促進SERCA2a對 Ca2+的攝取,進而增加了肌漿網(wǎng)Ca2+濃度和促進肌肉收縮時Ca2+的釋放終致心肌細胞收縮[9]。臨床研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者PLB Ser16和Thr17位點的磷酸化均下降,PLB的抑制作用明顯增強[10]。本實驗對各實驗組大鼠分別給予PKA特異性抑制劑(H-89),觀察各組PLB的表達水平和磷酸化水平以及心臟血流動力學改變。我們發(fā)現(xiàn)各H-89亞組較相應對照組PLBmRNA和蛋白表達水平明顯下降,同時PLB磷酸化水平亦降低;而且各H-89亞組的心臟收縮功能較對照組均下降。我們推測H-89可能通過cAMP-PKA通路抑制心肌肌漿網(wǎng)PLB磷酸化,使SERCA2a對Ca2+的攝取能力下降,導致心肌收縮功能減退,造成心力衰竭。

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